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1、PCR反应原理及其操作,生物化工 韩 栋,1.PCR的基本原理 2.PCR反应体系 3.PCR的基本步骤 4.PCR反应五要素 5. PCR 的反应流程,PCR的基本原理,试管中进行的DNA复制反应，依据 DNA半保留复制的机理； 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质； 通过人为控制体外合成系统的温度，使 双链DNA变成单链， 单链DNA与人工合成的引物退火， DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。,PCR反应体系,4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L,PC
2、R的基本步骤,72,94,55,PCR循环,PCR的基本步骤,1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94，30s）。 2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55，30s）。 3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（7072，3060s）,PCR的基本步骤,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA变性 形成2条单链,DNA单链 与引物复性,子链延伸 DNA加倍,高温变性,低温退火,中温延伸,PCR每一步的转换通过温度的改变控制。DNA模板解链（变性）、引物与模板结合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三
3、个步骤构成PCR反应的一个循环。 此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速扩增。,理论扩增率：2n递增（n为循环次数），2530循环，目标DNA可增加109倍。 实际扩增率：()n，X为PCR的实际扩增率，平均约为75%。 由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106107。 以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR一轮循环。,PCR扩增曲线,PCR反应五要素,1. 引物（primer） 2. 酶 （Taq DNA polymerase） 3. dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 4. 模
4、板 （template） 5. Mg2+ （magnesium）,1.引物,引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。,引物设计的原则,引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右； 引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb； 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列； 避免引物内部出现二级结
5、构：避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带； 引物3端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败； 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处； 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性； 引物量：每条引物的浓度0.1 0.5M，以最低引物量产生所需要的结果为好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,2 .酶及其浓度,目前有两种Taq DNA 聚合酶供应： 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大
6、肠菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100l时）； 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。,3.dNTP的质量与浓度,dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系： dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过
7、低又会降低PCR产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低,4.模板（靶基因target gene）,模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一； 传统DNA纯化方法：采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本； SDS：是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而 破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合 而沉淀； 蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇 或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。 临床检测标本：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色
8、体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增； RNA模板提取：采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA,5.Mg2+浓度,Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响; 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200mol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜; Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。,PCR 的反应流程,温度与时间的设置 循环次数,1、温度与时间的设置,设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060退火，然后快速升温
9、至7075延伸， 对于较短靶基因（长度100300bp）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸。, 变性温度与时间：,一般9394，1min足以使模板变性 若低于93则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。, 退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响PCR特异性的重要因素 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55作为选择最适退火温度的起点较为理想,Tm（解链温度）4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值（510） 在Tm值允许范围内，选择较高的复
10、性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 复性时间一般为3060s，足以使引物与模板之间完全结合,引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：, 延伸温度与时间：,延伸温度：一般选择在7075之间 常用温度为72 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 34kb的靶序列需34min 扩增10kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,2、循环次数,循环次数 决定PCR扩增程度 循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数：选在3040次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多,