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1、RAPD技术及其应用,汇报人：何 园 学 号：2014103015 时 间：2014.11.27,一.RAPD技术的提出,RAPD技术是20世纪90年代初由美国杜邦公司农产品研究中心的J.G .K.Williams和美国加利福尼亚生物研究所的J.Welsh两个研究小组几乎同时建立的检测随机扩增多态DNA的分子生物学技术。,二. RAPD技术的原理,图1. PCR过程示意图,理论基础：不同物种的基因组中与引物相匹配的碱基序列的空间位置和数目都有可能不同，所以，扩增产物的大小和数量也有可能不同，这些差异可以通过凝胶电泳显示出来。 基于这种理论，Williams将通常PCR扩增中使用的两个特定序列的
2、引物改为单一的由10个碱基构成的随机序列引物，并运用大量不同序列的引物进行扩增，最后经琼脂糖凝胶电泳分离和EB染色来检测DNA片段的多态性。,三. RAPD技术的应用,1.RAPD在微生物分类鉴定中应用 (1). 在原核生物分类中的应用 原核生物基因组结构简单，常采用培养特性、表型特征、生理生化特点等传统的分类鉴别方法，但这些方法不能完全准确、可靠地鉴别不同的型或亚型。RAPD分型、分类鉴别方法正越来越受到广泛的关注。,Hilton 等以随机引物“1254”(含10个寡核普酸碱基)扩增鉴别了20种不同血清型沙门氏菌，并进一步把RAPD扩增片段克隆到载体上，以地高辛杂交标记探针验证相关的RAPD
3、带，证明RAPD这种快速的分子分型方法对沙门氏菌基因分型是完全适用的。,(2).在Frankia分类鉴定中的应用 Frankia是一类共生固氮放线菌，能与多种树木形成根瘤。目前共有8个科，25个属，超过300个种，有极丰富的生物多样。Frankia在自然界与宿主植物共生，无法进行实验室纯培养，所以对Frankia的研究进展较慢。传统的分类方法对Frankia鉴定到种或亚种是很困难的。,RAPD由于不需设计特异的引物，一次可获得大量DNA多态性片段，这为在同一属或群下分类鉴别不同Frankia 种或亚种提供了潜在可行的方法。,2.构建遗传图谱,遗传图谱构建为遗传领域中研究的一个热点，迄今已对水稻
4、、玉米、小麦等许多重要作物进行了图谱构建，而林木的遗传图谱构建一直被视为作图研究的难区。,尹佟明等(1997)利用RAPD标记和单株树大配子体构建马尾松的分子标记连锁图谱。他们利用300个随机的寡聚核苷酸引物和马尾松种子的胚乳产生的随机扩增多态DNA(RAPD)分子标记，进行松标记连锁图谱的构建。,3.抗性基因研究,王京兆等(1996)筛选与杨树抗云斑天牛基因连锁的RAPD标记，用RAPD方法筛选到的RAPD标记不仅对分析和分离抗虫基因十分有用，而且在抗性育种的早期鉴定中也有重要用途。在选育过程中，不需进行抗虫实验，只要在苗期提取微量DNA，用OPAD01，作引物进行RAPD扩增，凡是有OPA
5、D011000这一多态性片段就是抗虫材料，这必将大大节省育种时间，提高育种效率。,4.亲缘关系分析,李宽钰(1997)用RAPD方法探讨毛白杨起源，从而探讨毛白杨与推测亲本亲缘关系，由此研究毛白杨的起源及演化机制。 冯丽春(1997)利用RAPD对桑属植物种间亲缘关系进行了研究，认为川桑与其他种的亲缘关系最远，是分化较独特的桑种之一，在UPGMA系统树上由结合线L2所划分的桑种类群与传统的形态分类基本一致。,5. RAPD技术在珍稀濒危植物研究和保护中的作用,RAPD技术不仅可以广泛应用于比较遗传多样性的复杂程度、探讨物种的系统发育情况及种质资源的鉴定等诸多方面,而且还为珍稀濒危植物的研究和保
6、护提供了理论依据,因此RAPD技术在研究珍稀濒危植物遗传多样性方面有着广泛的应用前景。,四. RAPD技术的优点,1.与RFLP法相比，RAPD法所需的模板DNA量少，要求纯度低，操作快，且无需知道DNA 序列的信息，而且获得基因图谱较迅速，标记密度大。 2. 不需要对每一种微生物进行鉴定，但需要筛选和比较随时间变化的不同样品中微生物的变化情况。 3.RAPD反应引物是随机排列的，无须专门设计，且引物较短(一般920 bp）故引物合成费用低，总成本低。,4.RAPD技术可以直接对所检测的DNA多态性进行分析,省去了许多如制备、克隆、同位素标记、Southern印迹、分子杂交等繁杂的工作。,五.
7、 RAPD技术的缺陷,RAPD技术重复性，结果的可靠性低,模板质量和浓度,短的引物序列,PCR循环次数,基因组DNA的复杂性,技术设备,六.解决办法,(1). 引物合成时需要满足以下两个条件： G+C的含量不低于40%，5和3端的碱基顺序非反向对称，否则无法合成专一性的DNA片段； 引物长度以10个碱基为宜，若引物太短（少于9个核苷酸长度），与模板结合有困难，聚合反应则很难进行。如果引物太长，成本增加，合成多态性DNA片段的可能性就会降低。,(2).操作规范,反应体系的组成要力求一致,尽快可能地使RAPD反应标准化； (3).提高扩增片段的分辨率；,Valentin认为毛细管区域电泳法是一种更
8、为灵敏、准确和经济的检测手段,同样条件下,以获得更多的RAPD扩增片段； 傅俊江等认为通过延长退火到延伸的ramp时间,可以提高RAPD技术的扩增效率。另外用荧光RAPD法;并用4%聚丙烯酰胺凝胶电泳，对提高RAPD的稳定性也极为有效。,(4).将RAPD标记转化为SCAR标记后,再进行常规 的PCR分析,可以提高反应的稳定性及可靠性。,七.参考文献,1.徐哓飞, 林炜铁, 彭智辉等. RAPD技术及其在微生物学方面的应用 J. 生命的化学, 2001, 5(21): 436-438. 2.刘建锋, 肖文发, 冯霞. RAPD技术在珍稀濒危植物遗传多样性研究中的应用 J. 林业科学, 2004, 3(40): 156-161. 3.吴少慧, 张成刚, 张忠泽. RAPD技术在微生物生物多样鉴定中的应用 J.微生物学杂志, 2000, 2(20): 44-47. 4.鲁亮, 归鸿. RAPD技术的特点及其在昆虫分类中的应用 J.昆虫学报, 1995, 1(38): 117-122. 5.邢秀芹. RAPD技术的应用 J.食品科技, 2010,12(35): 314-316.,谢谢,