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1、NFB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸对人翼状胬肉成纤维细胞增殖的影响【摘要】目的：研究2B抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(NF-BInhibitorpyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)对体外培养人翼状胬肉成纤维细胞增殖的影响,寻找辅助治疗和预防翼状胬肉复发的新方法。方法：取人翼状胬肉标本进行体外贴壁细胞常规培养，取第36代细胞进行试验。免疫组化法染色结合细胞生物学特征鉴定成纤维细胞；不同浓度PDTC(，5，10，20，40mol/L)干预成纤维细胞2己4，48，72h后,MTT法检测细胞生长抑制率；免疫细胞化学法分别检测P孵DTC干预48h后HPF增殖细胞核抗踽原(PCNA)的
2、表达情况。结果：体外培养的翼状胬肉细胞经免疫组化染色可见波形蛋白表达阳性，结合细胞生物学特性可以确定为成纤维细胞。MTT实验表明揉，随着PDTC干预浓度的增大和时间延醑长，成纤维细胞生长抑制率增加(P【关键词】吡咯烷二硫氨基甲酸翼状胬肉成廪纤维细胞增生抑制Effectofp篮yrrolidinedithioca览rbamateonprolifera甬tionofhumanpterygi擐umfibroblastsAbst队ractAIM:Tostudythe亏effectofpyrrolidin君edithiocarbamate(P琶DTC),apotentinhibi郐torofNF2B,p
3、rolife南rationandapop-tosisofhumanpterygiumfibroblasts(HPF)，in筚cultureandsearchfo猫ranewmethodtopreve拆nttherecurrenceaft潺erpterygiumsurgery灼.METHODS：Theprima背rycultureandsubcul帷tureofHPFswereesta续blishedinvitro.The瓦thirdtosixthpassag亏eofHPFswereusedinnextsteps:(1)HPFswe菹reidentifiedbythei绀mmunocytetoc
4、hemica渖lmethodofSABC.(2)H誓PFstreatedwithPDTC岫Immunocytechemical芙methodwereusedtoan洧alyzeexpressionsofproliferatingcelln筒uclearantigen(PCNA浃),respectivelyafte盒rHPFsbEingtreatedw沧ithPDTCfor48hours.瞍RESULTS:Theexpressionofvimentinincul钕turedcellwaspositi邵veandtheHPFswereidentified.Theprolif避erationinhi
5、bitoryr念ateofPDTConHPFsinc个reasedasincubationtimeandconcentrati姑onincreasing(PKEY觚WORDS:PDTC;humanpt轿erygiumfibroblast;隔prolifera-tion0引言翼状胬肉是较为常见的疾病，其发病机悛制仍不十分清楚。它以新生的纤维血管组藏织自球结膜生长侵入角膜为特点。治疗翼脘状胬肉的手术方法较多,但均不能有效地滕降低其复发率，因此寻找有效、副作用少繇的治疗方法是许多学者所面临的研究课题惺。PDTC已广泛用于体外培养的人视网膜色素上皮细胞的增生及人肺腺癌细胞A549细胞的生长抑制作用等方
6、面的研究屈。核因子2B是一种重要的核转录因子下，广泛存在于真核细胞内，是机体细胞间信号传导通路的重要因子1。研究发嗨现，NF2B活化后参与多种肿瘤的形成与发展1，在肿瘤组织中呈持续激柠活状态2。吡咯烷二硫氨基甲酸是N掘F2B特异性阻断剂，可抑制其活性绮2。翼状胬肉具有类似肿瘤的增生特点骅,但PDTC是否对翼状胬肉有作用尚待胆研究。为此，我们利用体外培养的翼状胬瘠肉成纤维细胞作为实验对象，观察PDT之C对其是否具有抑制作用如下。1材料构和方法材料体外培养的人翼状胬肉成纤铴维细胞，DMEM培养基，新生牛血清，1250胰蛋白酶、PDTC及噻唑蓝店，二甲基亚砜，小鼠抗人角蛋白及波形蛋白单克隆抗体、小鼠
7、抗人PCNA单克隆抗体为武汉博士德公司产品。胬肉组织标崭本为本院眼科手术切除组织，采用组织块筐培养法原代接种1d后，观察组织块贴壁樾情况、培养液色泽、细胞生长状况和形态丈特征等。48h后观察有细胞从组织块周宇围爬出，每34d更换1次培养液,待张细胞生长汇合至80%后以/L胰蛋白酶账消化细胞，按13分种传代。取传代细胞接种于预置盖玻片的6孔板，待细胞长沅满盖玻片,取出用无水乙醇+冷丙酮1瞟1混合固定15min，风干后HE染色鼽，并以抗波形蛋白和角蛋白抗体行免疫组化鉴定。图1HPF原代细胞组织片的边缘可见“毛刷状”缘，细胞呈火焰状或甘放射状延展，轮廓清晰，胞体透亮(1庆00)图2细胞波形蛋白表达阳
8、性，呈英现与成纤维细胞长轴方向一致棕黄色网状益或束状结构图3传代细胞轮廓清晰，呈瘵扁平多边状的上皮形态，胞内为淡红色，缋胞核边界清晰，有的可见“双核”(HE200)方法生长抑制率检测HPF细胞用含100g/L新生牛血清的D扩MEM培养基，于37，CO2培养箱噼内培养，/L胰蛋白酶消化传代。取对数生长期HPF细胞按1104/孔接种诙于96孔培养板，每孔加液200L。援设不接种细胞的空白组、对照组和PDT戴C组。24h后换液，对照组不加PDT圩C，PDTC组PDTC终浓度分别为，寐5，10，20，40mol/L。每不个浓度每个时间点设6个复孔。分别于PDTC干预24，48，72h加入5g鲒/LMT
9、T20L/孔，继续培养4h玮后吸出培养液，加入DMSO150L鸯/孔，振荡溶解10min，待结晶完全溶解后，在ELX800酶标仪上选择波顷长490nm，空白组调零，测定各孔吸光度，计算细胞生长的抑制率：抑制率=砝(1-PDTC组A值/对照组A值)渺100%。细胞PCNA表达检测采用痣免疫细胞化学法。取对数生长期HPF细簪胞1108/L接种于预置盖玻片的6秣孔板，24h后换液，对照组不加PDT吴C，PDTC组PDTC终浓度分别为，5，10，20，40mol/L，培芒养48h后/LPBS冲洗3次，冷丙酮无水乙醇11固定。采用SP法，操缎作按说明书进行，鼠抗PCNAmAb稀颖释度为150。胞核呈棕黄
10、色为PCNA阳性，PCNA表达强度用高清晰度彩匡色图像分析系统测定5个视野的吸光度，哿取平均值。随机计数100个细胞数出全参部阳性细胞及阴性细胞并列表。统计学处理：实验结果数据计量资料用表示，M丐TT抑制率同浓度和时间的关系采用方差楱分析。不同浓度PDTC对细胞作用结果徂与对照组的差异用软件进行t检验。细胞弩PCNA阳性表达数采用卡方检验。2拣结果PDTC作用后HPF生长抑制率报对照组细胞呈铺路石样、排列整齐贴壁生甏长;用药组细胞变圆、分布松散，且高剂貅量组细胞数明显减少。PDTC浓度mol/L时，能显著抑制HPF增生。嘉在40mol/L的浓度范围，抑制轻强度随浓度升高而加强(PHPF细胞P富
11、CNA表达细胞阳性表达显示为棕黄色、雹黄色或浅黄色细小均匀颗粒，分布于整个抒细胞核；细胞核无着色、胞内呈淡黄色者咤为阴性对照组。HPF细胞胞核呈棕黄色胭，PCNA表达强阳性；PDTC干预后磉，胞核染色变浅，且呈剂量依赖关系(P坭图4PDTC组细胞PCNA的表达3讨论翼状胬肉是局部球结膜纤维血栓管组织呈三角形膜样增生而侵犯角膜的一讫种眼表疾病,单眼或双眼受累。不仅直接影响美观,还可由于牵拉而引起眼部不适督及角膜散光,严重者影响视力及不同程度地影响眼球运动，是眼科的常见病、多发势病。病理学研究表明，它的主要成分是异燃常增生的成纤维细胞和新生血管3，具有类似肿瘤发生前的性质。纤维增生和新生血管化的范
12、围和程度是预测翼状胬肉臾切除术后复发的可靠形态学指标4。敞治疗翼状胬肉的手术方法较多，但均不能氪明显地降低其复发率。目前常采用抗增生娅药物，如5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、噻宠替派等单独或联合手术治疗试图降低翼状刎胬肉术后的复发率，临床观察对延缓胬肉呓发展具有一定疗效5。但这些药物对局部及全身有较大的毒副作用。因此寻找奢安全、有效的抗增殖药是许多学者所面临的研究课题。抗氧化剂PDTC可抑制N楔F2B的p65亚单位，并具有金属螯蕃合作用，是NF2B特异性阻断剂。在决抑制肿瘤的研究中发现其发挥作用的机制悃可能与下调NF-B，抑制iNOS,COX-2活性有关6，也可能是通锄过抑制细胞周期蛋白D和E的活性
13、或者刺激caspase-3，caspase-8的活性来降低Bcl-xL的水平来氪诱导细胞凋亡7。NF2B是一种翮p50、p65异源二聚体，在生理状态绫下与抑制蛋白IB在胞浆中结合，处于绶无活性状态；当细胞受到内毒素、过氧化芪物、生长因子、白介素、细胞毒素等刺激帆时，IB可泛素化和降解，NF2B殓活化，可参与和免疫、血管生成、抗肿瘤捎、炎症反应有关的基因转录调控，并与细泉胞增殖有关。目前认为，NF2B抑制揖细胞增殖作用主要与其抗凋亡、抗肿瘤和免疫激活功能有关8，同时与抑制新生血管也有关，通过抑制多种细胞NF宰B的活化和一系列依赖NFB细胞因子的分泌，这些细胞包括血管内皮细胞，血蹀管平滑肌细胞，巨
14、噬细胞9-11，瑙而这些细胞均参与新生血管的形成。因此推测PDTC通过抑制NF2B活性，抑制细胞增殖的作用。我们以不同浓度骂PDTC干预人翼状胬肉成纤维细胞后MTT法显示，PDTC可抑制人翼状胬肉松成纤维细胞生长,随着干预浓度的增大和时间延长，抑制率增加；我们还发现，P佃DTC干预人翼状胬肉成纤维细胞后,P疼CNA蛋白表达均下降，其下降程度与P髭DTC干预浓度均呈负相关。总之，本实歉验研究表明PDTC能时间、剂量依赖性徒的抑制HPF增生，提示PDTC对翼状烘胬肉的治疗具有潜在的应用前景，为翼状攀胬肉的药物治疗提供了一个新的思路。但詈目前研究仅限于离体实验，且PDTC发豹挥作用机制较为复杂，尚未
15、系统、明确地忍了解，有待进一步研究。【参考文献】1ShishodiaS,Aggar朵walBB.Nuclearfacto逊rkappaB:afriendor翅afoeintheCancer?BiochemPhramacol,XX;疋68(6):1071-10802C拎henF,CastranovaV,Shi,X,DemersLM.Newi狰nsightsintotherole纣ofnuclearfactor-kappaB,aubiquitoustranscriptionfactorintheinitiationofdi挫seases.ClinChem,19墁99;45(1):7-173Cor睨
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