普通级实验用猫金黄色葡萄球菌检测PCR法.doc

1、ICS65.020.30B 44DB22吉林省地方标准DB 22 XXXXX2020普通级实验用猫金黄色葡萄球菌检测PCR法Detection of conventional experimental cat staphylococcus aureus PCR methed（征求意见稿）2020 - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施吉林省市场监督管理厅发布DB22/ *20*前 言本标准按GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省科学技术厅提出并归口。本标准起草单位：吉林大学。本标准主要起草人：高飞，高巍，袁宝，任文陟，刘殿峰

2、张嘉保，陈健，胡进平，权福实。7普通级实验用猫金黄色葡萄球菌检测PCR法1 范围本标准主要规定了普通级实验用猫金黄色葡萄球菌PCR检测方法的技术要求。本部分适用于普通级实验用猫金黄色葡萄球菌检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范SN/T 3223 动物传染病PCR检测技术确认规范DB22/T 2591 普通级实验用猫 病原微生物监测标准3 原理聚合酶链式反应（PCR）以金黄色葡萄球菌的特异性nuc

3、基因为模板，以碱基配对和半保留复制为原理，合成一条新的与模板DNA互补的复制链，新复制链又可以作为下次循环反应的模板，保证了复制的准确性。PCR每一个循环反应需要2 min4 min即可完成，2 h3 h就能将目的DNA扩增几百万倍，从而就可以在较短的时间内获得检测所需的特定基因片段，最后扩增的目的基因可用电泳分析。4 材料4.1 器材4.1.1 高速离心机，1000 r/min20000 r/min4.1.2 PCR扩增仪4.1.3 稳压稳流电泳仪4.1.4 水平琼脂糖电泳槽4.1.5 凝胶成像系统4.1.6 恒温培养箱，36 1 4.1.7 分析天平4.1.8 微波炉4.1.9 平皿、三角

4、烧杯、试管4.1.10 接种环、接种针4.1.11 微量移液器（5 L50 L，50 L200 L，100 L1000 L）、配套吸头4.1.12 -20 冰箱，-80 冰箱4.1.13 均质器4.1.14 恒温水浴锅4.2 试剂4.2.1 金黄色葡萄球菌标准菌株4.2.2 7.5%氯化钠营养肉汤，配制方法见附录A。4.2.3 1.5%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A。4.2.4 溴化乙锭：10 mg/mL，配制方法见附录A；或其他等效产品。4.2.5 1%溴酚蓝，配制方法见附录A。4.2.6 50TAE电泳缓冲液，配制方法见附录A。4.2.7 无RNase去离子水，配制方法见附录A。4.2.8

5、DNA标准标志物：100 bp2000 bp。4.2.9 70%乙醇溶液（用无RNase去离子水配制）4.2.10 核苷酸混合物（dNTPs）4.2.11 溶菌酶4.2.12 溶壁酶4.2.13 Taq酶4.2.14 核糖核酸酶（RNase）4.2.15 异丙醇4.2.16 二乙胺四乙酸（EDTA）4.2.17 去离子水4.2.18 核溶解液，配制方法见附录A。4.2.19 蛋白质沉淀液，配制方法见附录A。4.2.20 引物：根据引物序列合成引物，引物中加入无RNase去离子水，配制成10 mol/L储备液，-20保存。4.2.21 引物序列引物序列如下：上游（F）5-GCTTGCTATGAT

6、TGTGGTAGCC-3下游（R）5-CTCTAGCAAGTCCCTTTTCCAC-35 检测程序采样及样品处理DNA的提取PCR扩增目的片段电泳检测PCR结果报告6 操作步骤6.1 采样样品采集操作、保存和运输按照NY/T 541的规定进行。6.1.1 脏器组织采集死亡动物可无菌采集胃、肠道或病灶组织。剪取待检样品约2 g放入无菌5 mL离心管中，加入4 mL7.5%氯化钠营养肉汤，用均质器将组织样品充分搅拌成均质，然后置于（361 ）培养箱中培养18 h-24 h，取上清液，编号备用。6.1.2 胃内容物、回盲部内容物采集死亡动物可无菌采集胃内容物、回盲部内容物。取待检样品约2 g放入无菌

7、5 mL离心管中，加入4 mL 7.5%氯化钠营养肉汤，用均质器将样品充分搅拌成均质，然后置于（361 ）培养箱中培养18 h-24 h，取上清液，编号备用。6.1.3 粪便采集活体动物可对其粪便进行采样。将粪便前段弃去，取中段粪便；对稀软便可直接接种；对干便可加入7.5%氯化钠营养肉汤没过粪便即可，然后匀浆化后再进行接种。取培养液1/10体积的粪便接种在7.5%氯化钠营养肉汤中，用均质器将样品充分搅拌成均质，置于（361 ）培养箱中培养18 h-24 h，取上清液，编号备用。6.1.4 病灶组织分泌物及浓汁采集活体动物固定后对其病灶周围用75%乙醇进行消毒，再用无菌接种环沾取分泌物或浓汁接种

8、在7.5%氯化钠营养肉汤中，置于（361 ）培养箱中培养18 h-24 h，取上清液，编号备用。6.2 样品的存放采集或处理的样品在28条件下保存应不超过24 h；如果需要长期保存，须放置在-80冰箱中，但要避免反复冻融（冻融不超过3次）。6.3 DNA的提取取1 mL样品培养液的上清，放入1.5 mL离心管中，13000 r/min 16000 r/min 离心2 min，保留沉淀物，弃去上清；向沉淀物中加入480 L 50 mM EDTA用移液器充分悬浮沉淀，再向其中加入60 L溶菌酶和60 L溶壁酶，用移液器轻轻混匀；将带有样品的离心管置于36 恒温水浴锅中30 min-60 min，然

9、后13000 r/min 16000r/min 离心2min，弃去上清；再向沉淀中加入600L核溶解液，轻轻悬浮沉淀，再经80 恒温水浴10 min，冷却至室温；加入3 L 核糖核酸酶，上下颠倒离心管2次-5次混匀，36 水浴15 min-60 min，冷却至室温；再加入200 L蛋白质沉淀液，充分混匀，置于冰上5 min；13000 r/min16000 r/min 离心10 min，将上清液移入新的1.5 mL离心管中，并向其中加入600 L异丙醇，轻轻上下颠倒离心管5次；13000 r/min 16000 r/min 离心3 min，弃去上清，添加600 L 70%乙醇，轻轻上下颠倒离心

10、管洗涤DNA沉淀；13000 r/min16000 r/min 离心3min，弃去上清；将离心管盖子敞开10 min15 min，晾干离心管中的DNA沉淀；向沉淀中加入100 L去离子水溶解DNA，65 水浴60 min，最后将DNA溶液放置在-20 冰箱中待检；若需长期储存需将DNA溶液放入-80 低温冰箱。如果采用商品化DNA提取试剂盒则根据试剂盒操作说明进行。6.4 PCR扩增目的片段6.4.1 反应体系PCR反应体系见表1，反应体系为25 L。反应液的配制在冰上操作，每次反应均设计阳性对照、阴性对照。其中，以金黄色葡萄球菌标准菌株DNA作为阳性对照；以不加金黄色葡萄球菌DNA的反应体系

11、作为阴性对照，即在反应中用水来代替DNA模板。表1 PCR反应体系反应组分用量/L10Buffer2.5dNTP（2.5 mol/L）0.7 Primer F（20 mol/L）0.25Primer R（20 mol/L）0.25DNA模板（20 ng/L50 ng/l）2.0 TaqE（5 U/L）0.7ddH2O（去离子水）18.6总体积256.4.2 PCR反应参数PCR反应参数见表2表2 PCR反应参数步骤温度/时间循环数预变性955 min1变性9540 s退火6030 s35延伸7260 s再延伸728 min1注：可使用其他等效PCR检测试剂盒进行，反应体系和反应参数可做相应调整

12、6.5 电泳检测PCR结果用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应结果：将适量50TAE稀释成1TAE溶液，配制含0.5 g/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，将配置好的凝胶板放入加满1TAE溶液的电泳槽中。取1%溴酚蓝染液与PCR产物按1:9比例混匀，用移液器取7 L15 L混有溴酚蓝的PCR产物加入到凝胶孔中，与适合的DNA标准标志物做对比；加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60 V100 V，样品由负极向正极方向移动，当溴酚蓝移动到距离胶板下缘约1 cm处时，停止电泳。再将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中，观察PCR反应结果。6.6 结果判断金黄色葡萄球菌DNA特异性扩增片段长度为422 bp，与

13、适合的DNA标准标志物比较，以判断样品中是否确为金黄色葡萄球菌。当6.6.1与6.6.2成立时，检测结果有效，可对结果进行判断。6.6.1 阳性对照琼脂凝胶在成像系统中观察到422 bp处有扩增目的条带。6.6.2 阴性对照琼脂凝胶在成像系统中观察到422 bp处无扩增目的条带。6.6.3 待检样品待检样品的琼脂糖凝胶在凝胶成像系统中未观察到422 bp处有扩增条带，样品检测结果为阴性；待检样品的琼脂糖凝胶在凝胶成像系统中观察到422 bp处有扩增条带，样品检测结果为阳性。6.6.4可疑样品可疑样品PCR产物需送至公司进行测序，当测序结果和PCR结果都确定为金黄色葡萄球菌时，样品检测结果为阳性

14、附 录 A（规范性附录）溶液的配制A.1 7.5%氯化钠营养肉汤称取蛋白胨10 g，牛肉浸粉3 g，氯化钠75 g，放入烧杯中，用1 L双蒸水加热搅拌充分溶解，调整PH值至7.40.2；121 高压灭菌15 min，密封冷却备用。A.2 1%溴酚蓝称取1 g水溶性钠型溴酚蓝放入烧杯中，再向烧杯中加入100 mL双蒸水，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。A.3 50TAE电泳缓冲液称取242 g 羟基甲基氨基甲烷（Tris）和 37.2g EDTANa22H2O 放入1 L烧杯中，再向烧杯中加入800 mL双蒸水，充分搅拌均匀；加入57.1 mL冰醋酸；用NaOH调PH至8.3，加双蒸水定容至1 L

15、室温保存备用。用时用双蒸水稀释至1使用。A.4 溴化乙锭称取20 mg溴化乙锭，用20 mL双蒸水将其充分溶解，浓度为10 mg/mL。A.5 含0.5 g/mL 溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶称取1.5 g琼脂糖放入烧杯中，加入100 mL 1TAE电泳缓冲液，混合后加热至完全融化，放在室温冷却至5055时，向其中加入5 L溴化乙锭，轻轻晃动混匀，避免产生气泡，将电泳梳子置入制胶板中，然后将琼脂糖溶液倒入制胶板，凝胶适宜厚度为3 mm5 mm，需确认在梳齿下或梳齿间没有气泡，待凝固后取下梳子备用。A.6 无RNase去离子水去离子水按体积比0.1%加入DEPC摇匀，室温静置过夜，121 高压

16、灭菌15 min，冷却备用。A.7 10% SDS溶液称取10 g十二烷基磺酸钠（SDS），用100 mL去离子水充分溶解，配成10% SDS溶液。A.8 2N NaOH溶液称取8 g NaOH，慢慢加入到带有80 mL去离子水的塑料烧杯中（NaOH溶解过程中大量放热，可能会使玻璃杯炸裂），边加边搅拌，待NaOH完全溶解后，再用去离子水将溶液体积定容至100 mL，即配制成2 N NaOH溶液，将溶液转移至塑料容器中，室温保存备用。A.9 核溶解液分别吸取50 mL10% SDS，50 mL 2N NaOH，加灭菌的去离子水定容至500 mL，现用现配。A.10 蛋白质沉淀液称取醋酸钾150 mg，冰醋酸11.5 mL，放入烧杯中，加入灭菌去离子水充分溶解，定容至100 mL。_