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1、基于电致化学发光技术的纳米生物传感器的设计与研究【摘要】：核酸、蛋白质及酶是组成生命的主要生物大分子。基因组核酸承载着传递遗传信息、编码生命功能的重要任务,基因的功能或表达则决定生命。蛋白质则贯穿所有的生命活动过程。酶在DNA合成中起重要作用,且在保持基因组的完整性方面也是必不可少的重要物质。核酸的复制、连接、修复等操作是重要的生命过程,DNA/RNA的结构片段,作为生物大分子的基本“砖块”,是生命活动的重要参与者,是重要的细胞信号传导物。基因的相关功能的完成需要蛋白质、酶及生物活性小分子化合物的协同参与,宏观上,这一系列生物分子的配合与作用构成生长、发育、繁殖、遗传和代谢等生命现象的基础。对
2、功能基因组、蛋白质组及相关生物活性分子的研究正是后基因组时代所关注的热点。随着科学家们逐渐揭开疾病的机理,并将其用于疾病的医疗诊断和治疗之中,对特定序列的DNA,相关蛋白、酶及生物活性小分子的检测日益受到重视。在传统的分析方法中,核酸与蛋白质的研究都采用放射性标记、凝胶电泳和放射性自显影等技术。这些方法过程复杂,周期长,特别是放射性标记,存在放射性污染。而非放射性标记法如荧光、化学发光和生物素标记法,标记过程繁琐、复杂,难以实现自动化且仪器价格昂贵。而生命科学的迅速、深入发展迫切需要新的手段和方法,以更灵敏、更真实、更快速地研究生命过程。电致化学发光(ECL),是由电化学反应直接或间接引发的化
3、学发光现象,是电化学和化学发光相结合的产物,兼具二者的优点。其方便快捷、灵敏度高、动力学响应范围宽、检出限低、可控性与选择性好、容易实现实时化和集成化,可进行原位检测。集以上优点于一身的电致化学发光技术近几年在分析化学,尤其在生物分析领域的应用引起了人们的极大关注,为生命科学进入到分子水平领域提供了有力的研究手段与方法。当物质小到纳米数量级时,会产生独特的表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等,其电学、磁学、光学和化学性质也相应地发生显著的变化,呈现出常规材料不具备的优越性能。因此,纳米材料在催化、电子材料、微器件、增强材料及传感器材料等方面有着广阔的应用前景。电化学过程与电极材
4、料的表面性质有关,如果将纳米材料修饰在电极的表面,基于其比表面积大、催化活性高、亲和力强的特性,其能活化电极表面,增大电流响应,降低检测限,大大提高检测的灵敏度,同时最大限度地保持相关生物分子的生物活性。将纳米技术应用于生物活性分子的电致化学发光分析研究,是一个崭新的领域,有利于创新性地建立一些新理论、新技术和新方法。本论文将纳米技术、生物分子识别元件的特异性及电致化学发光技术的灵敏性相结合,发展具有高灵敏度和高选择性的DNA、蛋白质及酶的新型纳米生物传感器。开拓生物传感器在后基因时代的研究领域,为研究多种生物分子提供新的手段与方法。论文分五个部分,共八章,具体内容如下:.绪论(第一章)本章系
5、统阐述了电致化学发光的原理和特点,重点介绍了ECL两大发光体系的反应机理及其在分析中的应用。介绍了DNA与核酸适配体电致化学发光生物传感器的构造原理、分类特点及研究进展。介绍了各种纳米材料在电致化学发光生物传感器中的应用。最后阐述了本论文的目的和意义,指出论文的创新之处及主要研究内容。.基于Ru(bpy)_3(2+)-SiO_2NPs的核酸适配体传感器实现凝血酶蛋白质电致化学发光特异性检测(第二、三章)第二章基于Ru(bpy)_3(2+)-SiO_2NPs的单核酸适配体传感器经目标诱导靶替换实现凝血酶蛋白质特异性检测利用反相微乳法合成了SiO_2包裹的电致化学发光活性物2,2-联吡啶钌(Ru(
6、bpy)_3(2+)纳米颗粒(Ru(bpy)_3(2+)-SiO_2NPs),以此作为DNA标记物,结合替换反应发展了一种简单有效的凝血酶蛋白质电致化学发光特异性检测的方法。首先,在金电极的表面组装凝血酶核酸适配体aptamer,将其与标记有Ru(bpy)_3(2+)-SiO_2NPs并与aptamer部分序列完全互补的ssDNA探针进行杂交,测得第一个ECL信号(I_(ECL1)。然后将电极与凝血酶蛋白进行培育,凝血酶与aptamer特异性结合,将探针替换下来,此时测得第二个ECL信号(I_(ECL2)。利用前后两个ECL信号的差值I_(ECL)(I_(ECL1)-I_(ECL2)来定量测定
7、凝血酶。非特异性识别的蛋白不干扰测定,凝血酶在1.010(-14)mol/L1.010(-11)mol/L范围内有良好的线性响应,检测限为1.010(-15)mol/L(S/N=3,n=11)。方法可应用于实际血浆中凝血酶的检测。第三章基于Ru(bpy)_3(2+)-SiO_2NPs的核酸适配体传感器经三明治传感系统实现凝血酶蛋白质特异性检测利用凝血酶的两段核酸适配体(aptamer,aptamer)与凝血酶的高亲和识别作用结合电致化学发光技术设计了一种具有高灵敏度和高选择性的蛋白质生物传感器。将一段15个碱基的aptamer通过Au-S键自组装到金电极表面,形成生物识别层,特异性“捕捉”目标
8、蛋白质凝血酶,进而结合另一段标记有Ru(bpy)_3(2+)-SiO_2NPs的29个碱基的aptamer探针构建三明治结构,在含有TPrA的检测液中通过检测Ru(bpy)_3(2+)的ECL信号对凝血酶进行定量检测。此传感器对非特异性识别的蛋白如牛血清白蛋白、牛血红蛋白不产生ECL响应,凝血酶在2.010(-15)mol/L2.010(-12)mol/L范围内有良好的线性响应,检测限为1.010(-15)mol/L(S/N=3,n=11)。.基于二茂铁标记分子灯塔构象变化的可控固相Ru(bpy)_3(2+)-电致化学发光膜及其特异性识别DNA、蛋白质及连接酶(第四、五和六章)第四章基于二茂铁
9、标记分子灯塔构象变化的可控固相Ru(bpy)_3(2+)-电致化学发光膜及其特异性识别DNA的研究基于二茂铁(Fc)对电致化学发光活性物Ru(bpy)_3(2+)的ECL的高效猝灭作用发展了一种可控的固相Ru(bpy)_3(2+)-ECL膜。修饰电极的ECL强度与Fc和固定在电极表面的Ru(bpy)_3(2+)的距离直接相关,这个距离由标记有Fc的分子灯塔(Fc-MB)的构象控制。我们尝试通过不同的途径改变Fc-MB的构象。Fc-MB与其环部碱基互补的DNA杂交,或者升温将Fc-MB及杂交得到的dsDNA解旋变性,都可以很好的改变Fc-MB的构象,进而改变修饰电极的ECL强度。系统研究了温度诱
10、导二茂铁标记分子灯塔及其系列杂交产物的构象转变过程,成功预言了相关生物分子的熔化温度。为深入研究分子灯塔键合平衡常数和茎环构象的热力学参数提供了一种新思路。同时,此固相Ru(bpy)_3(2+)-ECL膜可以特异性、高灵敏的测定靶DNA。第五章基于二茂铁标记分子灯塔适配体的固相电致化学发光传感器特异性识别凝血酶蛋白质通过纳米金胶将Ru(bpy)_3(2+)固定,利用二茂铁对Ru(bpy)_3(2+)的电致化学发光的高效猝灭,结合分子灯塔适配体的特殊茎环结构建立一种高灵敏的固相电致化学发光检测凝血酶的方法。通过凝血酶与灯塔环部核酸适配体的特异性结合来调整分子灯塔适配体的构象,即打开灯塔的茎部互补
11、碱基对,改变Fc与固定在电极上的Ru(bpy)_3(2+)的距离,通过调整前后修饰电极ECL信号的差值(I_(ECL)来定量测定凝血酶。非特异性识别的蛋白不干扰测定,凝血酶在1.010(-14)mol/L1.010(-11)mol/L范围内有良好的线性响应,检测限为1.010(-15)mol/L(S/N=3,n=11),并应用于混合蛋白样品的检测。第六章基于二茂铁标记分子灯塔的固相电致化学发光传感器特异性识别T4DNA连接酶利用二茂铁对Ru(bpy)_3(2+)的电致化学发光的高效猝灭,结合分子灯塔的特殊茎环结构及核酸连接的模板建立一种高灵敏的固相电致化学发光检测T4DNA连接酶的方法。通过T
12、4DNA连接酶连接修复与Fc标记的分子灯塔(Fc-MB)两端环部碱基完全互补的两条短链DNA,形成与Fc-MB完全互补的长链DNA,将Fc-MB的茎部互补碱基对彻底打开,改变Fc与固定在电极上的Ru(bpy)_3(2+)的距离,引起修饰电极的ECL信号的改变,通过前后ECL信号的差值(I_(ECL)来定量测定T4DNA连接酶。该酶传感器具有高的灵敏度和选择性,对T4DNA连接酶在5.010(-3)U/L5.010(-6)U/L范围内有良好的线性响应,检测限为2.510(-6)U/L(S/N=3,n=11)。.基于核酸适配体构象转换应用固相电致化学发光传感平台超灵敏检测腺苷(第七章)基于腺苷-核
13、酸适配体构象转换机制研制出一种高灵敏的固相电致化学发光检测腺苷的新型传感系统。把对Ru(bpy)_3(2+)的电致化学发光有高效猝灭作用的二茂铁分子标记在腺苷-核酸适配体上,腺苷-核酸适配体与腺苷特异性结合后,其构象会发生变化,引起标记物Fc与Ru(bpy)_3(2+)的距离变化,进而使得修饰电极的ECL信号发生变化,通过腺苷-核酸适配体构象转换前后修饰电极的ECL信号的差值来定量测定小分子腺苷。非特异性识别的其它小分子不干扰测定,腺苷在1.010(-8)mol/L1.010(-5)mol/L范围内有良好的线性响应,检测限为5.010(-9)mol/L(S/N=3,n=11)。回收试验结果满意
14、。简易、快速、低耗及良好的响应性能使本传感系统在构建基于核酸适配体传感器检测小分子的研究方法中体现出较好的发展前景。.应用MWNTs-Ru(bpy)_3(2+)混聚体经酶放大电致化学发光特异性识别p53基因(第八章)尝试通过多壁羧基化的碳纳米管(COOH-MWNTs)将Ru(bpy)_3(2+)固定,经吡咯膜(PPy)把MWNTs-Ru(bpy)_3(2+)混聚体与纳米金胶标记的DNA分析物相连,将葡萄糖脱氢酶参与的专一性的酶促反应与高灵敏的电致化学发光反应偶联,建立一种直接、准确的固相电致化学发光检测人类p53肿瘤抑制基因的方法。用此法检测目标p53野生型序列,检测限为1.010(-13)m
15、ol/L,在相同条件下,单碱基错配的p53突变型序列和p53野生型序列的区分度达56.3%,其特异性、低灵敏度的检测为癌症的早期诊断提供了可能。【关键词】：电致化学发光固相电致化学发光传感器核酸适配体分子灯塔构象转换【学位授予单位】：华东师范大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2008【分类号】：TP212.3【目录】：摘要10-15ABSTRACT15-21第一章绪论21-681电致化学发光及其在分析化学中的应用21-371.1电致化学发光的基本原理及特点211.2电致化学发光反应的主要体系及其应用21-371.2.1酰肼类化合物的ECL反应及其应用22-241.2.2金属有机配合物的E
16、CL反应及其应用24-372.DNA与核酸适配体电致化学发光生物传感器的研究进展37-472.1DNA电致化学发光生物传感器的研究进展37-442.1.1核酸分子结构372.1.2DNA生物传感器构成和原理37-382.1.3DNA生物传感器的类型38-392.1.4DNA电致化学发光生物传感器39-442.2核酸适配体电致化学发光生物传感器的研究进展44-462.2.1SELEX技术的简介44-452.2.2核酸适配体作为识别元件的优点452.2.3核酸适配体电致化学发光生物传感器45-462.3DNA与核酸适配体电致化学发光生物传感器的展望46-473纳米材料在电致化学发光生物传感器中的应
17、用47-553.1纳米材料的定义47-483.2纳米材料的基本特性48-493.3纳米材料在电致化学发光生物传感器中的应用49-553.3.1金属纳米粒子在电致化学发光生物传感器中的应用50-513.3.2碳纳米管在电致化学发光生物传感器中的应用51-523.3.3SIO_2纳米粒子在电致化学发光生物传感器中的应用52-543.3.4磁性纳米粒子在电致化学发光生物传感器中的应用54-554本论文的研究目的和意义55-57参考文献57-68第二章基于Ru(bpy)_3(2+)-SiO_2NPs的单核酸适配体传感器经目标诱导靶替换实现凝血酶蛋白质特异性检测68-851引言68-692实验部分69-
18、722.1仪器692.2试剂69-702.3.Ru(bpy)_3(2+)-SiO_2NPs纳米颗粒的合成和表面修饰70-712.4.Ru(bpy)_3(2+)-SiO_2-ssDNA探针的制备712.5aptamer/Au电极的制备712.6dsDNA/Au电极的制备712.7凝血酶蛋白质诱导靶替换Ru(bpy)_3(2+)-SiO_2-ssDNA探针71-722.8ECL检测722.9实际样品的处理723结果与讨论72-823.1Ru(bpy)_3(2+)-SiO_2NPs的性质72-733.2传感器检测过程的设计和特性73-753.3核酸适配体的选择75-763.4实验条件的优化76-80
19、3.4.1杂交条件的优化76-773.4.2凝血酶与核酸适配体结合条件的选择77-783.4.3ECL检测条件的优化78-803.5凝血酶检测的选择性803.6凝血酶的定量测定80-813.7实际样品的检测和分析81-824结论82参考文献82-85第三章基于Ru(bpy)_3(2+)-SiO_2NPs的核酸适配体传感器经三明治传感系统实现凝血酶蛋白质特异性检测85-951引言85-862实验部分86-882.1仪器862.2试剂86-872.3Ru(bpy)_3(2+)-SiO_2-aptamer探针的制备872.4aptamerI/Au修饰电极的制备872.5thrombin/aptame
20、rI/Au电极的制备872.6三明治复合物在金电极表面的构建87-882.7ECL检测882.8实际样品的处理883结果与讨论88-933.1传感器检测过程的设计和特性88-903.2thrombin与aptamer培育时间的影响903.3凝血酶检测的选择性90-923.4凝血酶的定量测定92-933.5实际样品的检测和分析934结论93参考文献93-95第四章基于二茂铁标记分子灯塔构象变化的可控固相Ru(bpy)_3(2+)-电致化学发光膜及其特异性识别DNA的研究95-1131引言95-972实验部分97-1002.1仪器972.2试剂97-982.3Fc-MB-Ru(bpy)_3(2+)
21、-AuNPs电极的制备98-992.3.1发光基底层在金电极上的构建98-992.3.2猝灭层在金电极上的构建992.4控制Fc-MB-Ru(bpy)_3(2+)-AuNPs电极的ECL强度的变化99-1002.5ECL检测1003结果与讨论100-1103.1AuNPs和Ru(bpy)_3(2+)-AuNPs的微观形态1003.2可控固相Ru(bpy)_3(2+)-电致化学发光膜的性质100-1023.3金胶修饰电极的真实面积和金胶的表面覆盖度102-1033.4Fc-MB在Ru(bpy)_3(2+)-AuNPs电极的表面覆盖度103-1043.5控制Fc-MB-Ru(bpy)_3(2+)-
22、AuNPS电极的ECL强度的变化104-1073.6可控固相Ru(bpy)_3(2+)-电致化学发光膜对DNA的识别107-1083.7杂交条件的优化108-1093.8可控固相Ru(bpy)_3(2+)-电致化学发光膜对靶DNA的定量测定109-1104结论110参考文献110-113第五章基于二茂铁标记分子灯塔适配体的固相电致化学发光传感器特异性识别凝血酶蛋白质113-1251引言113-1152试剂与仪器115-1162.1仪器1152.2试剂1152.3Fc-MBA-Ru(bpy)_3(2+)-AuNPs电极的制备1152.4Fc-MBA与凝血酶结合115-1162.5ECL检测116
23、3结果与讨论116-1213.1修饰电极的跟踪检测116-1183.2传感器检测过程的设计和特性118-1193.3凝血酶与二茂铁标记分子灯塔适配体培育时间的影响1193.4凝血酶检测的选择性119-1203.5凝血酶的定量测定120-1213.6混合蛋白样品测定1214结论121参考文献121-125第六章基于二茂铁标记分子灯塔的固相电致化学发光传感器特异性识别T4DNA连接酶125-1381引言125-1272试剂与仪器127-1282.1仪器1272.2试剂1272.3Fc-MB-Ru(bpy)_3(2+)-AuNPs电极的制备127-1282.4杂交反应1282.5连接反应1282.6
24、ECL检测1283结果与讨论128-1353.1修饰电极的跟踪检测128-1303.2传感器检测过程的设计和特性130-1313.3连接的特异性131-1333.4实验条件优化133-1343.5T4DNA连接酶的定量测定134-1354结论135-136参考文献136-138第七章基于核酸适配体构象转换应用固相电致化学发光传感平台超灵敏检测腺苷138-1511引言138-1402试剂与仪器140-1412.1仪器1402.2试剂1402.3发光基底层在金电极上的构建140-1412.4生物识别层在金电极上的构建1412.5杂交反应1412.6与腺苷培育反应1412.7ECL检测1413结果与
25、讨论141-1483.1传感器检测过程的设计和特性141-1453.2传感器选择性145-1463.3实验条件的优化146-1483.4腺苷的定量测定1483.5回收试验1484结论148-149参考文献149-151第八章应用MWNTs-Ru(bpy)_3(2+)混聚体经酶放大电致化学发光特异性识别p53基因151-1661引言151-1522试剂与仪器152-1552.1仪器152-1532.2试剂1532.3MWNTs-Ru(bpy)_3(2+)混聚体的制备153-1542.4纳米金胶标记p53基因的制备1542.5MWNTs-Ru(bpy)_3(2+)-PPy/Au电极的制备1542.6ssDNA/Au电极的制备1542.7dsDNA/Au电极的制备154-1552.8dsDNA-GDH/Au电极的制备1552.9ECL检测1553结果与讨论155-1633.1COOH-MWNTs和MWNTs-Ru(bpy)_3(2+)混聚体的微观形态155-1563.2传感器检测过程的设计和特性156-1583.3MWNTs-Ru(bpy)_3(2+)-PPy/Au电极的特性158-1603.4实验条件优化160-1623.5p53基因序列的定量检测162-1634结论163参考文献163-166附录:博士在读期间科研成果166-168致谢168 本论文购买请联系页眉网站。