《紫癜汤及其拆方对特发性血小板减少性紫癜模型小鼠网织血小板的发展.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《紫癜汤及其拆方对特发性血小板减少性紫癜模型小鼠网织血小板的发展.docx（4页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、紫癜汤及其拆方对特发性血小板减少性紫癜模型小鼠网织血小板的发展特发性血小板减少性紫癜（ITP），是由自身抗体引起血小板破坏的自身免疫性出血性疾病。因体内产生针对血小板和巨核细胞膜表面糖蛋白的自身抗体，使致敏血小板被网状内皮系统吞噬细胞破坏。依据其临床表现当属中医血证;、发斑;、衄血;、葡萄疫;、虚劳;等范畴，属本虚标实之证，主要病机为热（实热、虚热）、虚（气虚、血虚、阴虚）、瘀（血瘀）。紫癜汤是本校陶淑春教授根据多年临床经验，从本病气虚、血瘀认证建立该方，立方宗旨是益气养血、活血止血【1】。本实验旨在探讨紫癜汤及其不同配伍组方提升ITP模型小鼠血小板的作用机制，通过对紫癜汤拆方补益气血汤、补气
2、活血汤、补血活血汤进行综合效应比较，优化紫癜汤的处方结构。1 实验材料1.1 动物SPF级健康BalB/c小鼠，体质量1822 g，78周龄，84只，雌雄各半，北京维通利华动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2002-0003。1.2 药物紫癜汤组成：黄芪25 g，制大黄15 g，人参10 g，阿胶25 g，桃仁10 g，生地黄10 g，白芍20 g，仙鹤草15 g，当归10 g，甘草10 g。补益气血汤组成：黄芪25 g，人参10 g，甘草10 g，当归10 g，白芍20 g，阿胶25 g，生地黄10 g，仙鹤草15 g。补气活血汤组成：黄芪25 g，人参10 g，甘草10 g
3、，制大黄15 g，桃仁10 g，生地黄10 g，仙鹤草15 g。补血活血汤组成：当归10 g，白芍20 g，阿胶25 g，生地黄10 g，制大黄15 g，桃仁10 g，仙鹤草15 g。饮片均购自沈阳天益堂药房，煎煮由沈阳天益堂药房完成。醋酸泼尼松片由天津天药药业股份有限公司生产，批号040505。将醋酸泼尼松片研成粉末，用生理盐水配成混悬液（含药量0.72 g/L），置4 冰箱保存备用。1.3 主要试剂与仪器小鼠血小板生成素定量ELISA试剂盒，上海西唐生物科技有限公司提供；噻唑橙，Fluka公司生产；EDTA-Na2，沈阳市科华医用诊断用品经营有限公司提供；RPMI-1640，北京海克隆生物
4、化学制品有限公司生产，批号NRJ0024；小牛血清，Sigma公司生产；PBS购于博士德生物技术有限公司。血小板洗涤液组成：NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、EDTA-Na2、蒸馏水；豚鼠抗BalB/c小鼠血小板抗体（GP-APS）：根据文献【2】事先制备，-20 冰箱保存备用，使用前取出，56 水浴30 min，用等量BalB/c小鼠红细胞吸附2次，用生理盐水稀释成14浓度GP-APS待用。FACS Calibur型流式细胞仪，美国BD公司生产；HEMAVET950FS型全自动多物种五分类动物血液分析仪，英国DREW Scientific Inc.生产；TDL-5-A型离心机，上海安
5、亭科学仪器厂生产；101-1型电热鼓风恒温箱，河北黄骅市航天仪器厂生产；BL610型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司生产。2 实验方法2.1 造模与分组将BalB/c小鼠84只按血小板计数随机分为正常组、模型组、紫癜汤、补益气血组、补气活血组、补血活血组、泼尼松组，每组12只。除正常组不予特殊处理外，其余各组按免疫法建立慢性ITP小鼠模型。于实验第1、3、5、7、9、11、13日，小鼠腹腔注射GP-APS 100 μL/20 g。造模第5日开始灌胃给药。正常组、模型组给予生理盐水0.2 mL/只，紫癜方组给予紫癜汤0.43 mL/只，补益气血组给予补益气血汤0.36 mL/只，补气
6、活血组给予补气活血汤0.27 mL/只，补血活血组给予补血活血汤0.3 mL/只，泼尼松组给予醋酸泼尼松混悬液0.2 mL/只。每日1次，连续给药10 d后处死小鼠（即末次注射GP-APS后24 h）。各组小鼠每日给药剂量均相当于成人用药量的7.2倍。2.2 检测指标2.2.1 血小板计数检测 造模前、给药前及实验结束时眶静脉取血，加入带有EDTA-Na2固体抗凝剂的试管中，使血液与抗凝剂充分混均后，采用全自动多物种动物血液分析仪检测。2.2.2 网织血小板检测 按文献【4】方法检测，小鼠眶静脉取血，加入EDTA-Na2抗凝剂的试管中，混匀离心，将上清吸出，即为含血小板血浆。血小板洗涤液（pH
7、 7.4）加入PRP，离心，弃上清，加入1%甲醛，置4 冰箱中固定4 h。固定好的样本离心，弃上清，底层血小板用血小板洗涤液调节浓度约在100x109/L。吸出50 μL调好浓度的血小板悬液，取0.5 mL育1 h。同时另取1份血小板悬液加入PBS液作为空白对照。FACS Calibur流式细胞仪检测。按空白对照设定标尺，将阳性率控制在1%左右，同一标尺用于噻唑橙染色标本的荧光强度，结果以网织血小板（RP）百分率表示。RP绝对值=血小板计数xRP%。2.2.3 血清血小板生成素检测 采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测：实验结束时，小鼠眶静脉取血，加入试管中并静置2 h。3500 r/
8、min离心10 min，吸取上清液（血清），置-70 保存。检测时将血清一起溶化，按试剂盒说明书检测。步骤如下：建立标准曲线，在反应板上设标准孔6孔，第1孔为空白对照，第2孔为1000 pg/mL，第3孔为500 pg/mL，第4孔为250 pg/mL，第5孔为100 pg/mL，第6孔为50 pg/mL。将标本稀释液和待测血清各50 μL加入待测品孔中，充分混均后置37 恒温箱中30 min，取出后洗涤5次，每孔加第1抗体工作液50 μL后，置37 恒温箱中30 min，取出洗涤5次，每孔加酶标抗体工作液50 μL后，置37 恒温箱中60 min。取出后洗涤5次，每孔加底物
9、工作液100 μL，置37 恒温箱中反应510 min，每孔加入1滴终止液。在酶标仪450 nm处测血小板生成素（TPO）含量。3 统计学方法采用SPSS10.0统计软件进行分析。实验数据均用x±s表示，组间比较用方差分析，如不符合正态分布，用秩和检验，两个指标间相关性进行Correlate相关分析，多个处理组对多个变量影响差异比较用多变量方差分析。P0.05表示差异有统计学意义。4 结果4.1 紫癜汤及其拆方对小鼠血小板计数的影响注射GP-APS后，模型组小鼠外周血血小板计数明显下降，与造模前和正常组比较，差异有统计学意义（P0.05）。各给药组小鼠血小板值均提高，但只有
10、紫癜汤组、补气活血组、泼尼松组与给药前比较，差异有统计学意义（P0.05）。实验结束时与模型组比较，紫癜汤组、补气活血组、泼尼松组差异有统计学意义（P0.05）。结果见表1。5 讨论中医虽然没有ITP病名，但从历代文献中都可以找到类似此病的论述，其中所述治法治则、遣药组方原则对现代临床具有深远的指导意义。如灵枢-百病始生云：卒然多食饮则脉满，起居不节，用力过度则络脉伤。阳络伤则血外溢，血外溢则衄血；阴络伤则血内溢，血内溢则后血。;指出发生出血的原因及部位。外科正宗-葡萄疫曰：葡萄疫其患多生小儿。感受四时不正之气，郁于皮肤不散，结成大小青紫斑点，色若葡萄，发在遍体、头面，乃为腑证，自无表里。邪毒
11、传胃，牙根出血。久则虚人，斑渐方退。初起宜服羚羊散清热凉血，久则归脾汤滋益其内。;这段描述与现代小儿急性ITP相符，并且详细描写了发病原因、表现、疾病的发展过程及不同阶段的用药原则。综合分析，本病的病机主要有热迫血行、阴虚火旺、气不摄血、瘀血阻滞【5】，气虚、血瘀是关键环节，二者的改变会相应地引起更为复杂的变化。基于此，我们将紫癜汤的药物拆方组合成补益气血汤、补气活血汤、补血活血汤。实验结果表明，对ITP小鼠各检测指标综合调整效应，效果最好的是紫癜汤、补气活血汤，紫癜汤中补气类、活血类药所组成方的疗效与紫癜汤全方的疗效最接近，进而说明紫癜汤的核心结构是补气药、活血药。RP是Ingramt和Co
12、opersmithgf 1969年首先提出。RP是由骨髓释放出的新生的较幼稚的血小板，可反映人体内骨髓造血功能强弱和血小板的更新速度【6】。在ITP患者中，由于巨噬细胞的吞噬，血小板数量减少，骨髓中巨核细胞代偿性增生，新生血小板相对增多，故RP百分率增高。另外，ITP患者的骨髓巨核细胞代偿增生的能力低于外周血小板的破坏速度，所以RP绝对值较低。通过治疗过程的动态观察发现，血小板上升之前，首先出现RP百分率上升，随着RP逐渐成熟，以后释放的RP由于成熟血小板增加而被稀释，RP百分率逐渐下降，这提示RP百分率可用于预测药物对ITP的疗效。本实验结果表明，模型组小鼠RP显著高于正常组，说明ITP模型
13、小鼠属于骨髓巨核细胞增生型，与人类ITP病理变化相似。经治疗后各组RP明显降低，其中紫癜汤组与泼尼松组最为显著，补血活血组下降最不明显，对血小板提升的幅度最小，这一点与相关性分析的结果相吻合，即小鼠RP与血小板计数呈负相关。Kelemen等于1958年发现，在血小板减少症患者或动物血浆中存在一种可以促进巨核细胞的成熟及血小板生成的物质，称为TPO。TPO与其受体c-Mpl结合后可以刺激巨核细胞系的晚期前体细胞促其成熟，从而增加血小板的产量。若血小板计数正常，血小板上的高亲和性c-Mpl通过清除TPO以维持正常的血中TPO浓度。若血小板产量和血小板计数较低，TPO的总清除率就降低，进而增加了血中
14、TPO浓度和巨核细胞及血小板的产量【7】。有研究表明，急性血小板减少性紫癜（AITP）组与慢性血小板减少性紫癜（CITP）组TPO均高于对照组，但CITP组明显高于AITP组。本实验结果表明，模型组小鼠血清中TPO水平明显高于正常组。对照上述临床研究结果，这种状况类似CITP患者血清中TPO水平，进一步说明这种造模结果相当于CITP。各给药组治疗后TPO水平显著下降，且与正常组水平接近，各给药组间比较无明显差异。相关性分析发现，小鼠血清TPO水平与外周血血小板计数无关。这与文献结果一致。说明紫癜汤及其不同配伍组治疗ITP模型小鼠产生疗效的原因之一是调整血小板、血清TPO之间的平衡关系，使二者之间的动态平衡尽量恢复到正常的生理状态。参考文献：【1】 李海燕，陶淑春.陶淑春治疗原发性血小板减少性紫癜的经验.辽宁中医杂志，2003，30（1）：16-17.【2】 曲道炜，林庶茹，范颖.免疫法建立特发性血小板减少性紫瘫动物模型过程的改进及其体会.中医药学刊，2005，23（5）：928.