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1、1,酶促反应动力学研究方法介绍,碱性磷酸酶km值测定,2,实验目的 学习环境因素对酶促反应速度的影响； 学习米氏方程及Km值得测定； 测量碱性磷酸酶km值； 实验原理 E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包 括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等,3,（一）米曼氏方程式,中间产物,酶促反应模式中间产物学说,相关E学原理,4,1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。,S：底物浓度 V：不同S时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) m：米
2、氏常数(Michaelis constant),5,当反应速度为最大反应速度一半时,Km值的推导,KmS,Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。,6,（二）Km与Vmax的意义,Km值 Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。,7,Vmax 定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。,8,（三）m值与max值的测定,1. 双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝氏(Linew
3、eaver- Burk)作图法,9,2. Hanes作图法,在林贝氏方程基础上，两边同乘S,S/V=Km/Vmax + S/Vmax,10,酶浓度对反应速度的影响,当SE，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。 关系式为：V = K3 E,11,双重影响 温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低 。,温度对反应速度的影响,最适温度 (optimum temperature)： 酶促反应速度最快时的环境温度。,* 低温的应用,12,pH对反应速度的影响,最适pH (optimum pH)： 酶催化活性最大时的环境pH。,13,碱性磷酸酶km值的测定,14,操作,混匀后，37水浴15min,以第6管调0与650nm比色，读取各管A值。,15,实验数据及结果,以上述数据双倒数作图，求出碱性磷酸酶的Km值。,16,实验讨论,Km值的定义和意义是什么？ 米氏方程度表达式是什么，如何求出Vmax和Km？,17,现有某待测样品液5ml，将其稀释到100ml，取其稀释液1ml加入测定管按酚试剂法测其蛋白质含量，另取已知浓度的牛血清白蛋白溶液（250微克/ml）1ml加入标准管，其余操作同测定管。反应显色后测得吸光度分别为：A测=0.4，A标=0.25，求原样品液中的蛋白质含量（g/100ml） 0.8,18,