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1、,细胞展示技术在高通量筛选中的应用,生物化工2班,2011年10月,目录,什么是高通量筛选(High throughput screening，HTS) ？,是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机分析处理实验数据，在同一时间检测数以千万的样品，并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。 简而言之就是可以通过一次实验获得大量的信息，并从中找到有价值的信息。,高通量筛选技术体系的组成,1 化合物样品库,2 自动化操作系统,计算机及其操作软件,温孵离心设备,自动化加样设备,堆栈,A,B,C,D
2、,指在操作过程中用来放置样品板、反应板以及对它们进行转移所需的腾挪空间。,3 高灵敏度的检测系统,快速、高灵敏度的检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。 在高通量药物筛选中，检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。检测仪器灵敏度的不断提高，即使对微量样品的检测，也可以得到很好的检测效果。,4 数据库管理系统 高通量药物筛选的特点是对数以万计的化合物样品进行多模型的筛选。与高通量药物筛选相适应的数据库管理系统主要承担4个方面的功能。,高通量筛选技术采用的检测方法,1 光学测定技术 近年来，美、英两国研究人员在高通量筛选检测中，努力进行了光学测定方法的研究
3、，建立了大量的非同位素标记测定法，如用分光光度检测法筛选蛋白酪氨酸激酶抑制剂、组织纤溶酶原激活剂等，均获得成功。,2 放射性检测技术,美国学者GanieSM在高通量药物筛选研究中，应用放射性测定法，特别是亲和闪烁（SPA）检测方法，使在96孔板上进行的样本量实验得到发展。该方法灵敏度高，特异性强，促进了高通量药物筛选的实现，但存在环境污染问题。,3 荧光检测技术,美国学者GiulianokA研究认为，采用FLIPR（fluor ometricimaging readet）荧光检测法，可在短时间内同时测定荧光的强度和变化，对测定细胞内钙离子流及测定细胞内pH和细胞内钠离子流等，是非常理想的一种高
4、效检测方法。,4 多功能微板检测系统,由西安交通大学药学院研制的1536孔板高通量多功能微板检测系统，是目前国际上先进的高通量检测系统，它可使筛选量进一步提高，现已在该院投入使用。,高通量筛选特点,大量样品的快速筛选 分子和细胞水平的特异性作用靶点 检测系统的高灵敏度自动化操作 系统和数据采集传输处理系统,它具有微量、快速、灵敏和准确等特点,现已用于外源蛋白展示的体系有大肠杆菌中 的多种外膜蛋白、 鞭毛蛋白、 菌毛蛋白、 脂蛋白等,细胞展示技术,是将目的蛋白基因与细胞表面结构蛋白基因融合，使目的蛋白活性表达并锚定于细胞表面的一项技术。 主要用于研究细胞表面结构、 细胞表面蛋白的识别和相互作用。
5、,细胞表面展示技术的优势,是可利用荧光激活细胞分选法( FACS ) 作为检测手段来进行筛选。 该方法每秒可筛选至少5个样本。因此，只要将筛选文库的条件和此项技术结合起就可达到对细胞文库的高效率、 高通量筛选。,细胞展示技术,酵母表面展示技术,是继噬菌体表面展示技术后发展起来的真核展示技术，能够展示需糖基化作用 、二硫键异构化等翻译后修饰才具功能活性的复杂真核蛋白。 目前报道的两种酵母展示系统分别以a和凝集素为融合骨架，目的蛋白与之结合而展示于酵母细胞表面 。,作为候选的展示系统应满足的基本条件, 最小的表达偏差以使库的多样性得到最 大发挥，最大程度地展示其正确折叠的多 样性 有定量筛选标准
6、必须能很好地区分仅有微弱亲和力差别的 突变体 。,细菌表面展示技术,分为革兰氏阴性菌表面展示和革兰氏阳性菌表面展示两大类。 革兰氏阴性菌表面展示对于革兰氏阴性菌短的外源基因片段插人到大肠杆菌外膜蛋白和基因后 ，融合基 因产物可进人重组细胞外表面 、展示在外膜蛋 白上 。如一 融合展示系统已成功地使几种分子量为护一 的蛋白质以可接近的形式展示在大肠杆菌表面 。 革兰氏阳性菌表面展示 一些蛋白如抗原决定簇 、异源酶等 具有锚定到革兰氏阳性菌表面的特性许多革兰氏阳性菌表面受体的端也有类似结构，以相同或类似机制锚定于细胞表面 。等成功地在革兰 氏阳性菌表面展示 了聚组氨酸 。,革兰氏阳性菌与阴性菌两则
7、的比较,革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌转化率要低 ，但相对革兰 氏阴性菌而言，革兰氏阳性菌更具潜在应用价值。这是因为 在革兰 氏阳性菌中 ,蛋白转运仅需要穿越一层膜，而革兰氏阴性菌则需要通过 内 、外两层膜 革兰氏阳性菌外被有一层厚而坚韧的细胞壁，操作中细胞不易被破坏。,药物筛选,生物酶的定向进化,蛋白质固定化,细胞表面展示技术在高通量筛 选的应用,新药筛选的应用（酵母表面展示技术）,将未知功能的目的基因产物或特定病理过程相关蛋白产物展示在酵母表面 ，对 cDNA 表达文库或突变体库进行筛选 ,能发现与这些未知功能的基因产物或病理过程相关产物发生相互作用的物质 ，有助于对未知基因功能的研究，并能发
8、现一些药物作用的新靶点 ，或筛选到治疗疾病的新药先导化合物。 Kieke 将可溶性 T2细胞受体的 Vbeta8结构域和针对 c 2myc表位的抗体突变体连接到 scFv的C端并展示在酵母细胞表面，在加入荧光标记后，通过流式细胞仪检测到与 T2细胞受体亲和力高的 s cFv突变体，由此可以对抗原表位进行分析，找到药物靶点。 Vis intin将酵母表面展示技术与酵母双杂交技术相结合，将抗体的 s cFv片断连接到转录因子VP16的激活结构域(AD)上，将抗原连接到 LexA的结合结构域(DB)上，以 His3和 LacZ 为报告基因 ,建立抗原 - 抗体相互作用的展示方法。当抗原- 抗体发生相
9、互作用时 ,AD和DB 的结合将启动报告基因的表达 ,可通过营养缺陷培养基进行检测。这种方法从 s cFv突变体展示库中将有可能筛选到抗原特异的抗体 ,为疫苗及抗体类药物的研制提供良好的平台。,药物筛选的优点,充分利用药用资源 由于高通量筛选依赖数量庞大的样品库，实现了药物筛选的规模化，较大限度地利用了药用物质资源，提高了药物发现的几率，同时提高了发现新药的质量。 微量筛选系统 由于高通量筛选采用的是细胞、分子水平的筛选模型样品用量一般在微克级（g），节省了样品资源，奠定了“一药多筛”的物质基础，同时节省了实验材料，降低了单药筛选成本。 高度自动化操作 随着对高通量药物筛选的重视程度不断提高，
10、用于高通量药物筛选操作设备和检测仪器都有了长足发展，实现了计算机控制的自动化，减少了操作误差的发生，提高了筛选效率和结果的准确性。 多学科理论和技术的结合 在高通量筛选过程中，不仅应用了普通的药理学技术和理论，而且与药物化学、分子生物学、细胞生物学、数学、微生物学、计算机科学等多学科紧密结合。这种多学科的有机结合，在药物筛选领域产生大量新的课题和1发展机会，促进了药物筛选理论和技术的发展。,生物酶的定向进化,定向进化是在试管中模拟达尔文的进化理论， 其中涉及构建一个大的突变基因文库和高通量的筛选。突变文库由各种随机突变和体外基因重组方法构建。突变文库一经构建，就要进行筛选。首先筛选出有活性的突
11、变体； 然后进行下一轮的条件筛选，也就是某些抗性筛选。如此循环，最终筛选出具有新功能的突变体。在整个定向进化过程中，突变文库的构建和有意义突变的筛选是整个实验的核心。,几种定向筛选技术特性的比较,从上表可以看出，噬菌体表面展示技术具有筛选大容量突变体库的潜力而被广泛重视，但在应用中不能定量检测酶催化活性的微量差异细菌表面展示技术 、酵母表面展示技术等可以结合流式细胞仪，高通量筛选与测定单细胞水平的酶动力学之间达成很好的平衡 噬菌体表面展示技术 、酵母表面展示技术 、细菌表面展示技术等是良好的体内展示蛋白质的技术，但也存在一些自身所不能克服的缺陷，如每次突变之后必须重新进行连接和转化而损失其突变库多样性 。毫无疑问，这些高通量的筛选技术，无论是单个技术本身还是多个技术的融合，将会越来越广泛地应用于新蛋白质筛选和分离研究中。,Thank you,