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1、拟穴青蟹甲壳肽（Crustin ）的免疫功能研究拟穴青蟹 (Scylla paramamosain),简称青蟹 , 是我国重要的经济蟹类之一,广泛分布于我国的东海和南海等海域。近年来, 伴随着蟹类养殖规模的扩大以及其集约化养殖的发展 , 各种养殖病害频发严重制约了蟹类养殖产业的发展。青蟹凭借其独特的先天性免疫系统, 在外界不良生存环境中有效地抵御外界病原菌的入侵 , 因而其先天免疫防御机制的研究备受关注。甲壳肽 (Crustin)是甲壳动物免疫系统的重要效应分子, 本研究我们从青蟹中鉴定了3 个甲壳肽基因 ,分别命名为 SpCrus3、SpCrus4 和 SpCrus5。当前文献报道将甲壳肽分
2、为5 类, 在 I 型甲壳肽中 , 信号肽序列和 WAP结构域之间含一个半胱氨酸富含区。通过对获得的SpCrus3 和 SpCrus4 序列进行分析 ,我们发现这两个分子均属于I 型甲壳肽 , 并且这两个基因的cDNA序列含有相同的5端。表达模式分析显示 :SpCrus3 和 SpCrus4主要在鳃中表达 ; 在副溶血弧菌或金黄色葡萄球菌刺激后 ,SpCrus4 上调表达 , 而 SpCrus3 下调表达。 虽然 SpCrus3 和SpCrus4 具有 66.06%的相似性 , 但 SpCrus4 的抗菌活性强于 SpCrus3。微生物结合实验表明SpCrus3和 SpCrus4对所有受试微生
3、物均具有结合活性。多糖结合实验表明这两个蛋白对细菌多糖如脂多糖(LPS) 、脂磷壁酸 (LTA) 和肽聚糖 (PGN)都具有结合活性 , 并且 SpCrus3和 SpCrus4 对 LPS和 LTA的结合活性强于PGN。此外 ,SpCrus4 对 LTA的结合活性强于SpCrus3, 这可能是这两个蛋白之间抗菌活性呈现显著差异的原因。凝集实验表明SpCrus4 对微生物的凝集活性强于SpCrus3, 这种增强的凝集活性可能有助于SpCrus4 表现出更强的抗菌活性。基于以上结果 , 我们提出了 SpCrus3 和 SpCrus4 参与青蟹抗菌免疫的模型 :SpCrus3 在健康的青蟹中高度表达
4、以保持低水平的抗菌活性 ; 当细菌感染青蟹时 , 诱导产生大量的 SpCrus4 表现出对细菌更强的抗菌活性。根据当前分类标准 ,II 型甲壳肽在 N端邻近信号肽区有一段较长的富含甘氨酸的疏水区域 (GRR)和一个半胱氨酸富含区 , 同时在 C 端含有一个 WAP结构域。GRR结构域是区分 I 型和 II型甲壳肽的主要标记基序, 并且一些研究表明含有 GRR的 II型甲壳肽比 I 型甲壳肽具有更广泛的抗菌谱。我们发现SpCrus5 序列的 C 端含有一个 GRR结构域 , 这与经典的 II型甲壳肽的含有 N 端 GRRs结构域不同。表达模式分析显示 :SpCrus5 主要在鳃中表达 ; 在副溶
5、血弧菌或金黄色葡萄球菌刺激后 ,SpCrus5 上调表达 , 表明 SpCrus5 可能参与抗菌免疫反应。 为了进一步阐明这种 C 端 GRR结构域是否影响SpCrus5 的功能 , 我们通过删除 GRR结构域获得了 GRR缺失突变体 (SpCrus5-GRR)。SpCrus5 成熟蛋白的抗菌活性强于SpCrus5-GRR,前者对革兰氏阴性菌的抗菌谱也广于后者 ;SpCrus5 蛋白对微生物细胞的结合活性和多糖结合活性强于SpCrus5-GRR;SpCrus5和 SpCrus5-GRR凝集所有受试的革兰氏阳性菌。上述实验表明 ,SpCrus5 对微生物多糖的结合活性以及对微生物的凝集活性有助于
6、发挥其抗菌活性 , 并且其 C 端 GRR结构域能够增强 SpCrus5 的抗菌活性并拓宽其抗菌谱。虽然根据经典分类方法 ,SpCrus5 属于 I 型甲壳肽 , 但 SpCrus5 与大多数 II型甲壳肽具有高度相似性并且其功能与一些II 型甲壳肽相似 , 表明 SpCrus5更像一个非经典的 II型甲壳肽。综上所述 , 本研究对青蟹中3 个甲壳肽基因进行了表达模式及免疫功能研究 , 发现 SpCrus3、SpCrus4 和 SpCrus5 是青蟹免疫体系中的重要抗菌蛋白 , 它们以不同的方式参与青蟹免疫反应。本研究为了解甲壳肽序列和功能多样性、抗菌机制以及多个甲壳肽如何协作提供免疫保护提供了新的见解。