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1、牙鲆肠道益生菌的分离鉴定及其应用研究本研究从牙鲆肠道分离益生菌并对其进行鉴定, 研究了乳酸菌的粘附和定植,并探讨了益生菌在生产中的应用效果。各试验的研究结果如下:在试验一、试验二和试验三中 , 通过普通培养基和选择性培养基相结合的方法, 从健康牙鲆肠道固有菌群中分离益生菌, 共得到 6 株乳酸菌 ,6 株弧菌拮抗菌和24 株产蛋白酶菌。在 6 株乳酸菌中 , 其中一株 P15 经过生化生理和 16s rRNA 分子鉴定 , 为鼠李糖乳杆菌 ;P15 对弧菌有很强的抑制作用 , 在 pH6.8 和 pH7.5 生长良好 , 而在 pH8.0和 pH8.5 时该菌生长不良且无抑菌活性。在用点种法筛
2、选出的6 株弧菌拮抗菌中 ,G12、 G13、G14、G15、G16五株菌的上清液没有表现出抑制弧菌的作用。在 Y1-13 和弧菌的混合培养试验中 , 混和培养中弧菌的数量均明显低于对照组弧菌的数量 , 表明 Y1-13 对弧菌具有较强的抑制作用。利用酪蛋白培养基和脱脂乳培养基筛选出 24 株产蛋白的益生菌 , 并利用福林 - 酚试剂法测定其酶活力。结果表明 , 这 24 株菌均具有产蛋白酶酶活力 , 其中 E14、F1、G7和 Y2-2 产酶活力特别强。试验四、五测定了来自牙鲆肠道的鼠李糖乳杆菌P15和干酪乳杆菌的生长和 pH 的变化 , 并用同位素 (H3) 示踪法和异硫氰酸荧光素(FIT
3、C) 标记法对其在牙鲆的不同部位粘液的粘附进行了研究, 同时还研究了两种乳酸菌对四种致病菌的粘附抑制作用。结果表明 P15 在 25h-75h 期间为指数增长期 ,75h 后进入平台期 ; 干酪乳杆菌在 48h 前为指数增长期 ,48h 后进入平台期。两种菌都引起pH的降低 ,P15 的 pH值变化较干酪乳杆菌的变化明显。两种菌的培养上清液对非01 型霍乱弧菌、荧光假单胞菌的抑菌效果较明显,对嗜水气单胞菌和白色念珠菌没有抑菌作用。两种乳杆菌在牙鲆体表和肠道粘液中均有粘附性 , 在胃的粘附效果最好。两种标记方法都是两种菌在胃的粘附最好( 荧光标记试验中 ,P15 和干酪乳杆菌对胃粘液的粘附百分率
4、分别为63.0%和 48.48%)。采用荧光标记方法 , 干酪乳杆菌在牙鲆肠道内的粘附百分率是57.72%,P15 在牙鲆肠道内的粘附率是19.04%,干酪乳杆菌在牙鲆粘液内的粘附能力强于P15。两种乳酸菌均对皮肤粘液的粘附能力差。干酪乳杆菌使非01 型霍乱弧菌、白色念珠菌、荧光假单胞菌、 嗜水气单胞菌四种致病菌在牙鲆消化道粘液的平均粘附百分率分别下降了22.31%,5.15%,17.50%,12.69% 。对四种致病菌的抑制作用强弱的比较为: 非 01 型霍乱弧菌 > 荧光假单胞菌 > 嗜水气单胞菌 > 白色念珠菌。 P15 仅在盲囊粘液中对白色念珠菌有粘附抑制作用 , 并
5、使其他三种致病菌在牙鲆消化道粘液的平均粘附百分率分别下降了5.22%,19.01%,3.22%。P15对四种致病菌的抑制作用强弱的比较为: 荧光假单胞菌 > 非 01 型霍乱弧菌 > 嗜水气单胞菌。两种乳杆菌对牙鲆各部位粘液的粘附能力大小为: 胃 >盲囊 > 肠道 > 体表。四种致病菌在消化道的粘附能力均大于体表。试验六通过分别投喂含有1.2 109个 /g 乳杆菌的饲料 20 天, 研究 P15和干酪乳杆菌在牙鲆消化道的定植及抗生素对定植的影响。5 天后消化道定植的乳酸菌达到106 个 /g 以上 , 其后乳酸菌数量维持在106-108 个/g 动态平衡中。同时
6、随着乳酸菌数量的增加, 两组鱼消化道的弧菌数量均从 107-8 降低到 10 洲。停喂乳杆菌 7 天后 , 两个试验组鱼消化道的乳酸菌数量均从105-6 下降到 l少一 5 数量级 ,P15 组鱼小肠中弧菌数量从105 回升到 10, 数量级 , 干酪乳杆菌组鱼盲囊中弧菌数量从1 护回升到 10”数量级 , 小肠中弧菌数量也有显著的增加,从 6.28 增加到 6.66(LgN) 。结果说明 , 两种乳杆菌均能在牙虾消化道内定植 , 且定植无种属特异性。乳杆菌的投喂和定植 , 使牙螂消化道中的弧菌数量明显下降。每天按15mg/kg 体重投喂盐酸环丙沙星药饵, 处理 7 天后 , 鱼体内所测定的三
7、类细菌数均下降了 10一 102/g, 随后投喂 P15 和干酪乳杆菌带菌饲料 , 结果证实处理后幼鱼消化道较未处理组利于乳酸菌的定植, 定植数量显著高于未投喂药饵组(P<0 .01)。环丙沙星有利于幼鱼消化道菌群的重建, 但不影响乳酸菌定植的时间。试验七研究了乳酸菌对牙虾生长和肠道菌群的影响。结果表明 , 从牙虾肠道分离的乳酸菌具有促进牙虾肠道乳酸数量增加, 降低水中和消化道弧菌数量 , 提高成活率 , 促进生长的作用。试验八研究了产蛋白酶益生菌对牙虾生长、消化酶活性和肠道菌群的影响。结果表明 ,YZ-2 具有提高牙鲜消化酶活性, 促进牙奸生长的作用 ,Yl 一 13 具有抑制弧菌生长 , 促进乳酸菌增殖的效果。总之 , 在牙坪的消化道中 , 广泛分布着益生菌 , 我们可以通过普通培养和选择培养的方法分离得到。鼠李糖乳杆菌 P15 有很强的抑制弧菌活性, 对消化道粘液很强的粘附能力和在消化道很好的定植能力。 它可以降低牙鲜消化道和水中弧菌的数量, 促进生长 ,降低死亡率。芽抱杆菌 YZ 一 2 能增强牙虾消化道的蛋白酶活力, 促进牙鲜生长。 Yl 一 13能抑制水中和消化道中弧菌的生长。这三株菌均有望开发成在牙虾和其它鱼类养殖应用的益生菌。关键词: 乳酸菌弧菌拮抗菌产蛋白酶菌粘附粘附抑制定植肠道菌群酶活性牙奸护直r 。