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1、猫宿主限制因子BST-2 和 BCA2抗病毒机制的研究作为宿主限制因子 ,BST-2 蛋白可以有效阻断HIV 病毒和很多其他的包膜病毒 , 如马尔堡病毒、 SIV 病毒、拉沙热和埃博拉病毒样颗粒从被感染的细胞的细胞膜表面释放。在病毒复制的晚期阶段 ,BST-2 蛋白会在被感染的细胞表面捕获新生的病毒颗粒 , 防止病毒的释放 , 进一步促进病毒颗粒的内化并在核内体积累。一些报道声称 , 人类 BST-2 蛋白的胞质结构域存在着的几个不同的功能。最初报道了 N 末端胞质区融合 HA标签的人 BST-2 上每个结构域的缺失都会导致其抑制 HIV-1 病毒释放功能的严重损害。最近的研究表明 , 与其他
2、哺乳动物和非哺乳动物的同源物相比 , 猫的 BST-2蛋白具有非常短的N 末端胞质区域。然而 , 猫 BST-2 第一个起始密码子ATG上游包含的 57 个核苷酸序列 , 可能编码 19 个氨基酸 ( 命名为 f BST-2* 肽 ),f BST-2*肽与其他种属 BST-2 蛋白的 N 末端区域显示出很高的同源性。天然的猫 BST-2 蛋白能够阻止 FIV、HIV-1 、HIV-2ROD10、SIVmac239和 RD-114病毒颗粒的出芽。含有较长N 末端胞质同源物的人造猫BST-2*蛋白突变体则显示出有限的抗病毒能力。此外 , 绵羊 BST-2蛋白 A 是两种绵羊 BST-2蛋白同种型之
3、一 , 也保留了比人类BST-2 蛋白短的胞质区域。有趣的是, 这种较短的同种型被发现显示出比较长的同种型更强的抗病毒活性。Cocka和 Bates 的团队表示 , 从内部的第二个 ATG起始密码子开始编码的 , 人BST-2 蛋白天然存在的突变体可以部分抵抗Vpu蛋白对其的拮抗作用。 而我们团队之前的研究表明 , 人 BST-2 蛋白的 N 末端胞内区并不是限制HIV-1 病毒颗粒释放所必需的 , 但对于诱导细胞内信号传导是非常重要的; 在人 BST-2蛋白 N末端胞质区或胞外区靠近GPI 的区域插入 HA标签 , 会导致 BST-2 抗病毒功能的下降 , 同时也会影响其对NF-B 的活化功
4、能。基于这些观察 , 我们假设猫 BST-2 蛋白的较短的 N 末端胞质区域可能缺乏诱导 NF-B 活化的能力 ,HA 标签也可能会危害猫 BST-2 的功能。在本研究中 , 我们的结果提供证据表明 , 虽然猫 BST-2 与其他哺乳动物和非哺乳动物同源物相比具有更短的 N 末端胞质区 , 但其仍然保留针对 HIV-1 和 FIV 假病毒颗粒释放的抗病毒活性。然而 , 丢失的氨基酸序列被证明具有介导 NF-B 活化的能力。 此外 ,HA 标签在猫 BST-2 蛋白上的不同位置的融合可以不同程度地损害其抗病毒活性。N末端胞质区融合表达的 HA标签和人造 f BST-2* 肽段的添加可能影响重组的
5、 BST-2 与脂质膜 ( 如 ER)的相互作用。这种细胞内运输的损伤减少了N末端标记的 f BST-2-NHA 在细胞表面的定位 , 最终削弱了其抗病毒功能。同时 , 两个 N 连接糖基化修饰位点的突变(f BST-2 N79/119A)大大降低了 fBST-2 的抗病毒活性 , 但对单位点突变的突变体(f BST-2 N79和 f BST-2 N119A)的影响很小。 重要的是 , 这些观察结果表明 ,fBST-2*肽是在进化过程中被淘汰的,因为它的存在对野生型f BST-2 的影响最小 , 甚至保持了激活 NF- B 的能力。虽然 f BST-2 的抗病毒功能、 N连接糖基化修饰修饰和激
6、活NF-B 的能力可能是三个独立的生物功能, 但其抗病毒活性与其细胞表面表达量有关。这些结果为构建 BST-2 的结构功能模型提供了更多的细节和意义。此外 , 这些发现突出了在生物分子的功能研究中选择标签位置的重要性。乳腺癌相关基因 2(BCA2蛋白 ) 也称为无名指蛋白115(RNF115)或 Rabring7, 属于具有无名指结构域的E3 泛素连接酶家族 , 其在超过 50%的浸润性乳腺癌细胞中过表达 , 并且在体外实验中证实其与乳腺癌细胞的增殖相关。BCA2蛋白的过表达会增加NIH3T3成纤维细胞的增殖 , 而用 si RNA 在表达BCA2蛋白的乳腺癌细胞中沉默BCA2的表达后 , 可
7、以抑制该细胞的生长。BCA2蛋白具有自我泛素化活性 , 这种活性依赖于其C 末端的环指结构域 , 并且 BCA2蛋白N末端的锌指 (BZF) 结构域中 K26 K32 赖氨酸的突变能够消除其泛素化活性。同时 ,BCA2蛋白的 E3 连接酶活性已被证明是调节乳腺癌细胞迁移的重要因素。虽然 E3 泛素连接酶可以在致癌过程中发挥积极作用这一观点已经广泛接受,但是 E3 泛素连接酶相关的调节机理还未完全被了解。另外 , 人类 BCA2蛋白的抗病毒功能首先被鉴定为BST-2蛋白抗病毒的辅助因子 ,BCA2蛋白的 N末端与 HIV-1 和其他逆转录病毒 Gag蛋白的 Matrix 区域物理相互作用 , 并
8、促进其泛素化 , 再被分配到溶酶体内室 , 最终被降解 ; 并且 BCA2蛋白还能够通过抑制 NF-B 的激活来限制 HIV-1 转录。然而 , 猫 BCA2(f BCA2)是否是 E3 泛素连接酶 , 并且是否有抑制病毒释放的能力并不清楚。本实验中 ,f BCA2蛋白首先被鉴定为属于保守的 E3 泛素连接酶家族。 f BCA2蛋白的 C 末端的环指结构域对于其自我泛素化是必不可少的。总体而言 , 这些结果表明 , 猫 BCA2蛋白与人类 BCA2蛋白的相似 , 具有自我泛素化特征。这一特性可能在猫科动物乳腺癌中起重要作用, 有助于在猫模型中研究乳腺癌 ; 也可能与 BCA2的抗病毒功能相关
9、, 有助于对 BCA2蛋白的抗病毒功能进行进一步研究。接着 , 我们研究了 f BCA2 对 HIV-1 的拮抗作用 , 以及 h BCA2和 f BCA2 对于FIV-Vif-Orf A-Env-GFP假病毒的抗病毒功能。发现f BCA2 抑制 HIV-1病毒释放的机制与h BCA2存在一些相同点和不同点。相同点是 : 它们都能够降解 HIV-1 Gag 蛋白 ; 也都能够通过抑制HIV-1 对于NF- B 的激活来抑制 HIV-1 的转录。不同点是h BCA2能够诱导 HIV-1 病毒颗粒的溶酶体途径降解 , 而 f BCA2 没有这个功能。另外 , 在研究 BCA2对 FIV-Vif-O
10、rf A-Env-GFP假病毒的抑制机理中 ,我们发现与 BCA2蛋白抑制 HIV-1 的机理也有些许不同 :BCA2蛋白不能诱导 FIV-Vif-Orf A-Env-GFP假病毒颗粒的溶酶体途径降解;BCA2蛋白也不能介导FIV Gag蛋白的降解。 然而 ,BCA2 蛋白能够通过抑制FIV 对于 NF-B 的激活来抑制 FIV 假病毒的转录。这些研究结果表明 ,BCA2蛋白抗逆转录病毒的机制, 可能主要是抑制病毒的转录 , 而对于 Gag蛋白的降解和诱导病毒颗粒的溶酶体途径降解都是其辅助功能。另外 ,BCA2蛋白的环指结构域对于其降解HIV-1 Gag 蛋白的功能是必需的 , 然而环指结构域的突变体并没有完全失去抑制病毒转录的功能。这些结果将有助于对BCA2抗病毒机制的理解 , 从而有助于建立研究HIV感染的动物模型。总而言之 , 对猫免疫缺陷病毒及猫类宿主限制因子之间相互作用的研究将为建立猫类HIV-1 动物模型提供理论支持 , 具有理论和现实意义。