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1、鸭源鸡杆菌中国株外膜蛋白W基因鉴定及其敲除株的构建鸭源鸡杆菌是巴氏杆菌科鸡杆菌属的代表种, 为革兰氏阴性菌。研究表明其在一定条件下能够引起蛋鸡生殖系统的损伤、腹膜炎及败血症和呼吸道疾病等,造成产蛋量下降 , 死亡率上升。鸭源鸡杆菌存在多重耐药性及固有抗原的多样性, 这使得抗生素及疫苗对该病的防治效果不甚理想 , 给养殖业带来的经济损失越来越严重。目前 , 鸭源鸡杆菌致病机理的研究还十分有限, 仅有少数几个预测的毒力因子得到的确认, 其中包括新型的 RTX毒素 Gtx A 、多糖荚膜、金属蛋白酶和粘附素等。本试验首次针对鸭源鸡杆菌外膜蛋白W(OmpW)开展了初步研究 , 首先借助PCR及生物信息
2、学方法 , 获得了 OmpW基因在鸭源鸡杆菌中分布状态、预测了其可能存在的抗原表位 , 并利用鸭源鸡杆菌OmpW的原核表达产物制备多克隆抗体, 对其免疫原性进行了研究。 为进一步的研究OmpW基因的功能 , 本试验首次在国内利用靶向基因操作技术成功构建了鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因突变株omp W。1. 鸭源鸡杆菌外膜蛋白 W基因扩增及生物信息学分析本研究参照 GenBank中公布的 UMN179的 OmpW基因序列 , 设计一对通用引物 , 通过 PCR对 32 株不同来源的鸭源鸡杆菌OmpW基因进行扩增 , 首次对鸭源鸡杆菌OmpW基因的存在状态进行分析 , 并借助生物信息学方法 , 对 Yu
3、-PDS-RZ-1-SLG株 OmpW氨基酸序列进行分析 , 预测其理化特性、结构特征及保守的B 细胞优势抗原表位。结果显示,OmpW基因在鸭源鸡杆菌基因组中广泛存在, 并具有较高的保守性 ;OmpW为筒状结构 ,其四个高变区均位于胞外; 同时不同菌株具有共同的B 细胞抗原表位 , 它们之间可能具有交叉免疫原性。本研究结果为鸭源源鸡杆菌诊断方法的建立、新型高效疫苗的研制及OmpW基因功能的研究奠定基础。 2. 鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因的表达及抗原性鉴定本试验应用 PCR技术扩增了去信号肽的鸭源鸡杆菌OmpW基因片段 , 将扩增片段成功克隆到表达载体p ET-28a, 转化到 BL21 中, 并
4、利用 IPTG 诱导 , 成功对鸭源鸡杆菌OmpW进行原核表达。将上述经纯化的表达产物免疫家兔, 获得抗 OmpW的多克隆抗血清 , 并通过Western blotting初步鉴定了其免疫原性。结果显示, 重组蛋白 OmpW具有良好的免疫原性 , 而且制备的抗 OmpW多抗能够与不同的鸭源鸡杆菌发生免疫反应, 这不仅表明 OmpW成为具有交叉免疫保护性疫苗的潜能, 而且有望基于 OmpW建立鸭源鸡杆菌的血清学检测方法, 同时该研究为后续OmpW基因缺失突变株的构建提供可靠的检测依据。3. 鸭源鸡杆菌 OmpW基因敲除株的构建本研究根据 GenBank中发表的鸭源鸡杆菌 OmpW基因序列的上下游
5、基因序列设计两对上下臂引物, 利用 PCR方法从鸭源鸡杆菌 Yu-PDS-RZ-1-SLG株基因组中扩增 OmpW基因上游、下游同源臂 , 将其分别克隆至 p MD18-T 载体中获得重组质粒p SX, 随后将氯霉素抗性盒子插入到上下游同源臂之间 , 从而构建了质粒 p SCX。设计 1 对特异性引物 , 利用 PCR方法获得SCXDNA片段 , 并将其通过自然转化法成功转入Yu-PDS-RZ-1-SLG株, 经同源重组使氯霉素抗性盒子代替基因组中的OmpW基因 , 并分别通过 PCR及 WesternBlotting在基因及蛋白水平对其进行鉴定, 最终获得具有氯霉素抗性的OmpW突变株。鸭源鸡杆菌OmpW突变株的成功构建不仅为其OmpW的功能研究奠定了良好的基础 , 而且为该菌其它基因的研究将提供了更为可靠的方法。