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1、鸡 INF- -C3d 在毕赤酵母中的表达及抗病毒活性测定近年来 , 禽类养殖业在不断扩大 , 人们对于禽肉和蛋类的消费水平也在不断提升 , 但抗生素药物滥用现象愈来愈严重, 各种超级细菌和病毒层出不穷, 传统的禽类疫苗已经无法满足市场需求, 开发新型疫苗迫在眉睫。目前已经开发出的新型疫苗需要佐剂的添加来提高其免疫水平, 干扰素和补体分子是目前已证明的具有佐剂效应的活性分子 , 但目前的报道都是对二者单独进行的, 本实验欲将 IFN-和补体 C3d串联表达 , 并与单独表达的IFN- 对比 , 观察其抗病毒活性。本实验成功获取了目的基因chIFN- 和 chIFN- -C3d, 并构建了真核重
2、组质粒 pPICZA-chIFN- 和 pPICZ A-chIFN- -C3d, 通过酶切鉴定和测序鉴定来验证构建的正确性。构建成功后, 将真核质粒 pPICZA-chIFN- 和 pPICZA-chIFN- -C3d 线性化后电转化导入毕赤酵母SMD1168中, 甲醇诱导目的蛋白的表达 , 并对其最佳诱导时间进行了选择。SDS-PAGE结果表明 ,chIFN- 和 chIFN- -C3d 在 17KDa和 21KDa各有一个条带 , 与理论值相符 ,Western-Blotting检测也验证了目的蛋白表达的正确性。重组蛋白表达成功后 , 用镍柱对重组蛋白进行纯化, 纯化后蛋白浓度为chIFN
3、- 0.427mg/mL,chIFN- -C3d 1.069mg/mL。将本实验中真核表达的重组蛋白chIFN- 和 chIFN- -C3d 以及实验室保存的原核表达的重组蛋白chIFN- 和 chIFN- -C3d 进行鸡胚内和鸡胚成纤维细胞(CEF)抗病毒活性比较。在鸡胚内进行的抗病毒实验结果表明, 四个重组蛋白均具有较好的抗病毒活性 , 与病毒组相比差异极显著(P<0.01),在低浓度时 ,chIFN- 比 chIFN- -C3d 效果好 , 高浓度时 ,chIFN- -C3d 组病毒滴度明显下降 , 差异极显著 (P<0.01),原核表达的 chIFN- -C3d 与真核表
4、达的 chIFN- -C3d 抗病毒活性差异不显著 (P>0.05),在 CEF上进行的抗病毒实验结果表明在相同处理方式下 , 从病毒滴度测定结果来看, 四个重组蛋白之间无明显差异,但 chIFN- -C3d 效果要好于 chIFN- ,MTT测定表明四个重组蛋白抗病毒效果显著 , 与病毒组相比差异极显著 (P<0.01) 。四个重组蛋白都随着浓度的增大抗病毒效果逐渐增强 , 但差异不显著(P>0.05)。总体来看 ,chIFN- -C3d 效果要好于 chIFN- , 本实验真核表达的重组蛋白好于实验室保存的原核表达的重组蛋白, 但差异不显著 (P>0.05)。综上所述 , 本实验成功在毕赤酵母中表达了重组蛋白chIFN- 和 chIFN- -C3d, 它们都具有良好的抗病毒活性, 为后面进行免疫佐剂功能研究奠定了基础,也为新型疫苗免疫佐剂开发提供了一种新的思路。