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1、鱼类卵黄高磷蛋白衍生多肽中和LPS作用及红景天苷抗炎作用机理的研究脂多糖 lipopolysaccharide(LPS) 又称为内毒素 , 是革兰氏阴性细胞细胞壁的重要组成部分 , 是一种高度保守的病原相关分子模式pathogen-associatedmolecular parttems (PAMPs)。LPS可以通过诱导促炎因子的上调表达进而引发宿主细胞的炎症反应。炎症因子的过量表达最终会导致脓毒症的发生, 严重时可导致宿主死亡。由于目前临床上还没有治疗LPS引起的脓毒症特效药物 , 因此 , 寻找可以阻止 LPS对宿主先天性免疫反应的激活的新型试剂是非常必要与急切的。在本研究中 , 我们鉴
2、定出两种潜在的内毒素中和剂-Pt5 和红景天苷 , 并且探讨了它们的作用机制。 卵黄蛋白原的功能在早期一直被认为在胚胎发育提供中提供营养物质 , 我们在近期的研究中发现它还有免疫功能。卵黄高磷蛋白是卵黄蛋白原降解衍生蛋白质之一。我们实验室前期研究发现重组的斑马鱼卵黄高磷蛋白具有一定的LPS中和作用 , 它可以结合病原相关分子模式 LPS、脂磷壁酸 (LTA) 和肽聚糖 (PGN), 并有着一定的抑菌功能。为了寻找卵黄高磷蛋白的抑菌活性中心, 我们在之前的研究中采用氨基端截短表达的方法 , 发现羧基端的 55 个氨基酸 (Pt5) 残基仍有一定的免疫活性。本研究对 Pt5 进行了 LPS中和活性
3、的研究。我们对 Pt5 进行了定点突变 , 找出了比 Pt5 具有更高抑菌活性的多肽Pt5e,并确定了 Pt5e 与 Pt5 一样具有广谱的抑菌活性, 在较低的浓度下即可抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生长。通过酶联免疫吸附实验(ELISA) 证明重组 Pt5 可以与 LPS和 LTA 结合。为了验证将来 Pt5e 能否应用于人类疾病上 , 我们使用 MTT和溶血实验 , 验证了 Pt5e 对小鼠巨噬细胞 (RAW264.7)不具有细胞毒性并且对人类血红细胞不具有溶血活性。我们使用 LPS和 Pt5e 处理 RAW264.7,通过 ELISA 检测细胞上清的炎症因子 TNF-和 IL-1p 的
4、含量 , 发现 Pt5e 可以显著降低这两种炎症因子水平。接下来 , 我们将 LPS和 Pt5e 腹腔注射到小鼠体内 , 一定时间后检测小鼠血清中炎症因子 TNF-和 IL-1p 的浓度发现 Pt5e 也显著降低了血清中这两种炎症因子浓度 , 说明 Pt5e 具有体内和体外中和 LPS的功能。在使用半致死实验验 Pt5e是否对脓毒症小鼠起到保护作用的实验中, 我们发现 Pt5e 有效的提高脓毒症小鼠的存活率 (p<0.05)。体内试验表明在腹腔同时注射LPS和 Pt5e 的小鼠组其抑制脓毒症的能力显著高于仅注射 LPS的对照小鼠组。本研究表明 Pt5e 不仅可以抑制病原菌的生长,还具有
5、LPS中和作用 , 这一发现有助于新型的临床抗脓毒症药物的开发。红景天苷是一种存在于红景天植物根茎中的葡萄糖苷。我们实验室前期研究发现本实验结果表明在中, 红景天苷可以促进老龄大鼠的免疫应答, 提高其抗氧化能力 , 从而发挥其抗衰老的作用。本研究发现红景天苷可以抑制LPS诱发的炎症反应。红景天苷可以有效地抑制炎症因子类反式激活因子(CIITA) 、环氧合酶 -2(COX-2) 、一氧化氮合酶(iNOS) 、白细胞介素 -1 (IL-1 ) 、白细胞介素 -6(IL-6)和肿瘤坏死因子a(TNF-a) 等炎症相关因子的表达。为了解析红景天苷抑制LPS诱发炎症反应的机制 , 我们检测了三条已报道的
6、可被 LPS诱发的炎症通路 (MAPK、 JAK-STAT 和 PI3-K-Akt信号通路 ) 中部分关键因子的蛋白表达水平和磷酸化水平。该实验结果表明红景天苷可以显著降低PI3-K-Akt通路中的 Akt 磷酸化水平和NF-B 通路中的 NF- B 磷酸化水平(p<0.05),而对 MAPK和 JAK-STAT中的关键因子并没有影响。与此相一致 , 通过抑制 PI3-K-Akt 通路中的上游因子 P13-K后发现 , 红景天苷对 Akt 和 NF-B 磷酸化水平的抑制水平显著降低。 基于上述实验 , 我们得知景天苷可以通过阻断 PI3-K-Akt 信号通路的方式抑制来抑制 LPS诱发的炎症反应。这一研究表明红景苷有可能成为治疗脓毒症的辅助药物。