《改性聚乙烯亚胺及其叶酸修饰的反义寡核苷酸传递系统的研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《改性聚乙烯亚胺及其叶酸修饰的反义寡核苷酸传递系统的研究.docx（4页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、改性聚乙烯亚胺及其叶酸修饰的反义寡核苷酸传递系统的研究在肿瘤治疗领域中 , 反义寡核苷酸 (Antisense oligonucleotide,AS-ODN)类药物及相关治疗技术越来越得到大家的重视。目前虽然已有AS-ODN类药物进入临床阶段 , 但仍存在稳定性差、跨膜能力弱、易被核酸酶降解等问题。LOR-2501是一种含有 20 个碱基的 AS-ODN,因为能够与核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotidereductase,RNR) 大亚基 R1 的 m RNA编码区互补 , 具有一定的抗肿瘤活性。目前大量的研究集中于AS-ODN类药物载体的开发和应用领域。聚乙烯亚胺 (Polyethy
2、leneimine,PEI)与其他阳离子聚合物相比, 有着独特的“质子海绵效应” ,PEI 装载药物后能够通过大量的氨基吸收质子, 导致溶酶体渗透性肿胀 , 破裂后将药物释放到细胞质中。PEI 作为 AS-ODN载体时 , 高分子量的 PEI(25k Da)转染效率相对较高但是毒性较大 , 而低分子量的 PEI(800 Da)毒性较小但转染效率也相对较低 , 因此如何通过 PEI 的改性和靶向配体修饰等研究方法在提高 PEI 转染效率的同时减少其毒性成为了研究热点。本论文研究内容主要包括以下几部分 :1.PEI-SS-OA 的合成及载药系统的建立本文首先在 PEI 的基础上 , 合成了一种含有
3、二硫键 (S-S) 的聚合物 , 使用油胺(Oleylamine,OA) 对其进行了疏水性修饰 ( 命名为 PEI-SS-OA)。同时采用乙醇注入法制备了 PEI-SS-OA载药系统。制备的 PEI-SS-OA载药系统具有一定的缓冲容量, 进入细胞后能够有效地释放自身携带的药物。在最优制备条件下的粒径为201.0 5.9 nm,zeta电位值为43.5 0.9 m V 。PEI-SS-OA对 He La 和 A549 细胞无明显毒性 , 细胞活力均在 90%以上。在 30天内 ,PEI-SS-OA 载药系统的粒径略有增加,zeta电位值无明显变化。2.PEI-SS-OA/LOR-2501 传递
4、系统的建立和评价为了对制备的PEI-SS-OA载体的转染效率进行评价 , 本文选择了一种AS-ODN类药物 LOR-2501,建立了PEI-SS-OA/LOR-2501传递系统。首先以粒径和zeta 电位为指标 , 得到了最佳的氮磷比 (N/P) 为 8:1 。此时 ,PEI-SS-OA 与 LOR-2501已完全结合 , 还原剂的加入能够促使LOR-2501的释放。体外细胞评价实验中,MTT抗肿瘤实验和流式细胞计数法测定转染效率实验结果表明制备的PEI-SS-OA 载体能够将 LOR-2501转染进入到 He La 和 A549细胞中 , 抑制肿瘤细胞的生长。采用激光共聚焦显微镜观察到PEI
5、-SS-OA/LOR-2501复合物能够大量地进入到肿瘤细胞。实时荧光定量PCR测定 R1 m RNA结果显示 , 复合物在 He La 和 A549细胞中对 R1 mRNA的下调效率分别为 40.8%和 43.6%, 与 PEI 相比分别提高了 17.8%和 23.3%。Western-blot测定 R1蛋白结果显示 ,PEI-SS-OA 组的 R1 蛋白下调效率明显高于 PEI 组。 3.PEI-NH-OA 的合成及载药系统的建立本文同时在PEI 的基础上 ,合成了一种含有酰胺键 (N-H) 的聚合物 , 使用油酰 (Oleoacyl,OA) 对其进行了疏水性修饰 ( 命名为 PEI-NH
6、-OA)。采用乙醇注入法制备了PEI-NH-OA载药系统。 PEI-NH-OA同样具有一定的缓冲容量。在最优制备条件下的粒径为102.0 3.9 nm,zeta 电位值为 54.5 3.1 m V。PEI-NH-OA与 PEI 本身相比毒性明显减小 ,He La 和 A549细胞活力均在 90%以上。在 30 天内 ,PEI-NH-OA 载药系统粒径和zeta 电位均无明显变化。与PEI-SS-OA载药系统相比 ,PEI-NH-OA 载药系统粒径更小 , 阳离子特性更强 , 具有更好的稳定性。4.PEI-NH-OA/LOR-2501传递系统的建立和评价本文同时建立了PEI-NH-OA/LOR-
7、2501传递系统 , 对 PEI-NH-OA的转染效率进行了评价。 以粒径和zeta 电位为指标 , 得到了最佳的N/P 为 6:1 。此时 ,PEI-NH-OA 与 LOR-2501已完全结合 , 形成纳米复合物。抗肿瘤实验显示复合物对 He La 和 A549 细胞的抑制率分别为46.2%和 41.5%。通过流式细胞计数和激光共聚焦显微镜观察发现, 复合物能够大量地进入到He La 和 A549 肿瘤细胞内。实时荧光定量 PCR测定 R1 mRNA结果显示 ,PEI-NH-OA作为载体时 , 在 He La 和 A549细胞中对 R1 mRNA的下调效率分别为37.7%和 34.5%,而
8、PEI 组仅为 20%左右。Western-blot测定 R1蛋白结果显示 ,R1 蛋白的下调率分别为50.1%和 46.3%。可见 PEI-NH-OA能够高效地将 LOR-2501转染进入细胞 , 与 PEI-SS-OA相比稳定性较高且粒径较小 , 后期实验中选择对其进行进一步修饰。5.FA/PEI-NH-OA/LOR-2501 传递系统的建立和评价本文在PEI-NH-OA/LOR-2501复合物基础上 , 进一步将叶酸 (Folic acid,FA)与上述复合物通过静电吸附作用结合, 得到 FA/PEI-NH-OA/LOR-2501传递系统。FA/PEI-NH-OA/LOR-2501复合物
9、在最佳比例时粒径为159.0 1.1 nm,zeta电位值为 -12.2 1.3 m V, 加入 FA后的 PEI-NH-OA载体仍能够与 LOR-2501紧密结合。FA/PEI-NH-OA载体无明显毒性 , 细胞活力均在 80%以上。体外细胞抗肿瘤评价实验中 , 对 He La 和 A549 细胞的抑制率分别达到55.6%和 53.7%。流式细胞计数检测转染效率结果显示, 复合物在叶酸受体高表达(FR+)的 HeLa 细胞中和叶酸受体低表达(FR-) 的 A549细胞中 , 平均荧光强度是 FA修饰前的 2倍以上 , 在 KB细胞 (FR+)和 SK-HEP-1细胞 (FR-) 中同样出现此
10、现象。激光共聚焦显微镜观察结果显示复合物能够大量地进入到肿瘤细胞中。R1 m RNA测定结果显示 , 在 He La 和 A549 细胞中 ,R1 m RNA下调效率分别为51.7%和 45.7%。Western-blot测定 R1蛋白结果显示 ,R1 蛋白下调效率分别达到72.0%和 68.9%, 与未修饰的载体相比大幅提高。6.FA/PEI-NH-OA/LOR-2501 传递系统内化机制的初步研究首先考察了游离FA对 FA/PEI-NH-OA/LOR-2501纳米复合物进入肿瘤细胞过程的影响。结果显示 ,加入浓度为 0.01 、0.1 、1 mmol/L 的游离 FA 组与未加入游离 FA
11、 组相比 , 无论在He La、 KB细胞 (FR+)还是 A549、SK-HEP-1细胞 (FR-) 中, 并没有对复合物的摄取情况有一定的影响。同时考察了三种内吞途径抑制剂蔗糖、细胞松弛素 D 和制霉菌素对复合物内吞过程的影响。结果显示, 复合物可能主要是通过网格蛋白介导的内吞途径进入到细胞中的。使用三种内化途径特异性染料标记细胞后, 采用激光共聚焦显微镜观察复合物的摄取情况 , 结果进一步验证了复合物主要是通过网格蛋白介导的内吞途径进入到肿瘤细胞的。综上所述 , 本文中制备的疏水改性的PEI 及其 FA 修饰的载药系统具有低毒高效的特点 ,FA/PEI-NH-OA 载药系统的转染效率与肿瘤细胞表面的FR表达量无关 , 在多种肿瘤细胞系中均具有较高的转染效率, 有望成为安全高效的 AS-ODN类药物载体。的的 的