《猪流行性腹泻病毒血清学与抑制病毒入侵细胞的研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《猪流行性腹泻病毒血清学与抑制病毒入侵细胞的研究.docx（3页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、猪流行性腹泻病毒血清学与抑制病毒入侵细胞的研究猪流行性腹泻病毒 (Porcineepidemic diarrheavirus,PEDV) 是急性、高度传染性猪流行性腹泻 (Porcineepidemic diarrhea,PED) 的致病原 , 可感染所有日龄的猪 , 并在哺乳仔猪中引起较高的死亡率。 本研究主要对 PEDV编码的结构或非结构蛋白进行表达纯化 , 并以此为检测抗原建立敏感有效的血清学检测方法, 对感染或免疫 PEDV后不同日龄猪体内的抗体消长规律进行监测; 同时以制备的抗PEDV的单抗为基础 , 对 PEDV入侵机制进行初步研究。根据 PEDV G2毒株 (GenBank ac
2、cession no.KU558701) 基因序列设计特异性引物 , 以其 cDNA为模板分别扩增 PEDVS1、E、ORF3C、非结构蛋白 nsp1、nsp2 以及 nsp3 中 Ac(Acidicdomain) 、ADRP(ADP-ribose-1-monophosphatase domain)功能域 , 克隆到真核或原核表达载体中, 构建重组表达质粒 , 利用真核或原核表达系统表达相应蛋白 , 并进行层析纯化 , 经 SDS-PAGE检测、 Westernblot鉴定正确后 , 作为免疫原 , 免疫新西兰大白兔 , 制备相应的兔抗 PEDV多克隆抗体 ;Westernblot和 IFA
3、鉴定获得的抗体有较好的反应性和特异性,ELISA 检测其效价均达到1:100000 以上 , 可满足后期试验需要。用 PEDVG2毒株感染 Vero 细胞 , 扩增病毒。蔗糖密度梯度离心纯化PEDV细胞毒 , 制备纯化的 PEDV全病毒颗粒 ; 同时分别以前期制备的 PEDVS1蛋白、ORF3C蛋白和 E 蛋白作为检测抗原 , 方阵滴定法确定PEDV纯化全病毒颗粒、 S1 蛋白、 ORF3C蛋白和 E 蛋白的最佳抗原包被浓度分别是 5 g/mL、4.4 ng/mL、 15.6 ng/mL、7.8 ng/mL; 最佳一抗稀释度均为 1:100,最佳二抗稀释度为1:10000; 并对抗原包被条件、
4、抗体作用时间、孵育温度等条件进行优化 , 最终分别建立以 PEDV全病毒和 S1 蛋白为抗原的间接ELISA 方法检测临床样本中抗PEDV IgG和 IgA 抗体 , 以 PEDV ORF3C和 E 蛋白为抗原的间接ELISA 方法检测样本中抗PEDVIgG抗体。用上述方法检测国内不同猪场中有腹泻症状的不同年龄段的猪初乳、奶、血清、粪便等不同样本中抗PEDV抗体的存在情况 ; 结果显示 , 所检样本中普遍存在抗PEDV抗体 ; 相比之下 , 母猪中抗 PEDV抗体水平较高 ,0-1W 龄中也存在较高水平的抗PEDV抗体 , 但在 3W龄猪中抗体水平开始下降 ,7W 龄时抗体水平有所上升 ,13
5、W 和 20W龄时抗体水平基本不变 ; 这与当前不同年龄段猪感染PEDV的情况基本相符。同时 , 本研究对部分猪血清中抗PEDV中和抗体进行随机抽检 , 结果表明 , 抗PEDV抗体水平高的样本中的中和抗体水平也较高, 即本研究所建立的ELISA检测方法与中和试验检测结果基本一致, 有较高的可信度。用上述间接ELISA 方法和Western blot 、IFA(Immunofluorescence)检测 PEDV全病毒颗粒、PEDVS1、ORF3、E 及 nsp1、nsp2、nsp3-Ac 和 nsp3-ADRP 蛋白与临床 PEDV感染猪血清样品中抗PEDV抗体的反应性 . 结果显示 , 虽
6、然 S1和 Ac 蛋白在 IFA 检测中均出现特异性荧光 , 但在 Western blot 检测中 ,S1 蛋白的敏感度和特异性更高。对 951 份感染状态未知的猪血清的 ELISA检测结果显示 , 上述 PEDV蛋白均有一定反应性。而 PEDV S1、 ORF3C、E 蛋白和 PEDV全病毒纯化抗原检测均显示出相似的抗体消长趋势 , 且抗 PEDVIgG抗体均在 1 周龄仔猪中最早出现。同时 , 对 30 份未感染 PEDV的仔猪阴性血清检测显示 , 上述所有蛋白作为检测抗原均未出现反应 ; 即本研究制备的检测抗原均有高度特异性。 综上所述 ,PEDVS1蛋白可作为 PEDV感染检测的最佳
7、血清学诊断抗原。用 PEDV S1蛋白为免疫原 , 免疫 6-8 周龄 BABL/C小鼠 , 按照传统杂交瘤细胞技术制备抗 PEDVS1单克隆抗体 ; 最终获得 4 株稳定分泌抗 PEDVS1 蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 , 分别命名为 2C2G11、2G4C5、3B10G8和 7D7G1;ELISA检测4 个单抗的亚型均为IgG1; 杂交瘤上清效价均可以达到1:10 以上 ; 腹水效价则均可达到 1:1000 以上 ; 体外中和试验检测其中和活性, 按照 Reed-Muench两氏法计算测定 4 个单抗均有一定中和效价, 其中单抗 2C2G11和 3B10G8中和效价可以达到 1:200
8、 以上 ;Western blot 检测其均出现特异性条带 , 表明本试验制备的单抗有良好的抗原反应性 ;IFA 检测 4 个单抗均出现特异性荧光 , 表明这些单抗可以在不同程度上识别 PEDV天然构象 ; 综合上述表明 , 本试验制备得到的抗 PEDVS1单抗可以作为后续 PEDV入侵机制研究的重要工具。 利用真核系统表达 PEDVS1各个截短蛋白 :SlO(aa1 219) 、 OA(aa1504) 、B(aa 510-640) 和 CD(aa 639729) 蛋白 , 用 Protein A柱子亲和纯化 ,Western blot检测反应性 ; 随后 , 利用本研究制备得到的抗 PEDVS1 蛋白中和性单抗 , 以上述蛋白为抗原 , 对 PEDVS1 蛋白的主要抗原表位进行 ELISA 检测 ; 同时选择 S1 蛋白 OA和 CD进行抑制病毒入侵试验; 结果表明 ,S1 的各个截短蛋白均正确表达, 且有较好的反应性 ;PEDVS1蛋白的中和表位可能位于 OA区和 CD区;OA 与 CD蛋白均能抑制病毒入侵; 受体结合域可能位于 CD区, 即 PEDV S1蛋白的中和表位也可能是其受体结合域。