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1、玉米茎腐病与穗腐病致病镰孢菌侵染途径及其致病力差异研究玉米茎腐病与玉米穗腐病同是玉米生产中的重要病害, 在我国的各玉米生产区均有报道发生。随着我国秸秆还田政策的推广, 秸秆中的病原菌在可土壤中存活 , 致病镰孢菌在土壤中的含量增多 , 导致玉米茎腐病与穗腐病的发生逐年加重。玉米茎腐病可造成植株易倒伏及影响籽粒千粒重 , 造成产量损失 ; 穗腐病不仅会降低玉米产量 , 其病原真菌产生的毒素会影响玉米品质, 籽粒作为食物、饲料或加工产品被食用可威胁人畜的健康。玉米茎腐病与穗腐病均可由禾谷镰孢菌（ Fusarium graminearum）与轮枝镰孢菌（ Fusarium verticillioid
2、es）侵染引起 , 且两种病害间的同种镰孢菌可以进行交互侵染。目前 , 对于这两种镰孢菌引起的茎腐病和穗腐病相互关系尚不明确。本文对玉米茎腐病与玉米穗腐病致病镰孢菌禾谷镰孢菌与轮枝镰孢菌的亲缘关系、致病性及侵染途径进行了系统研究, 利用绿色荧光蛋白转化菌株接种玉米, 并在玉米整个生长期观察分析转化菌株的侵染情况, 以明确这两种病害间的同一镰孢菌引起玉米茎腐病与穗腐病的关系。对综合防控这两种病害及抗病品种的选育提供依据, 具有重要意义。主要研究结果如下 :1. 我国东北地区玉米茎腐病与穗腐病致病镰孢菌种群结构及遗传多样性分析从东北地区辽宁省、吉林省、黑龙江省和内蒙古省的42 个市县玉米产区采集病
3、样后 , 经分离纯化获得 295 株镰孢菌 , 在形态学鉴定基础上 , 采用延长因子 EF-1序列分子学鉴定 , 明确玉米茎腐病与穗腐病致病镰孢菌共分为7 个种 :禾谷镰孢菌（ F.graminearum ）、轮枝镰孢菌（ F.verticillioides）、胶孢镰孢菌（ F.subglutinans）、层出镰孢菌（F.proliferatum）、木贼镰孢菌（F.equisetu ）、F.temperatu以及 F.incarnatum 。其中 , 玉米茎腐病的优势种为禾谷镰孢菌, 玉米穗腐病的优势种为轮枝镰孢菌。利用 ISSR技术研究两种病害的同一种病原菌, 结果显示 :ISSR 分子标记
4、技术对于禾谷镰孢菌 , 其能够在亚种水平将禾谷镰孢菌复合种进行区分, 但不能划分出来源于不同病害的同一种禾谷镰孢菌;ISSR 技术对于轮枝镰孢菌分析, 不能将两种病害的轮枝镰孢菌进行区分。2. 来源于玉米茎腐病与穗腐病的同一种镰孢菌致病性存在异同玉米茎腐病苗期、成株期与穗腐病致病力测定三组试验 , 不同病害的同一镰孢菌对玉米致病性各有异同。茎腐病苗期试验中 , 分离自茎腐病的禾谷镰孢菌致病力高于穗腐病禾谷镰孢菌 , 两个病害的轮枝镰孢菌致病力差异不大 ; 玉米茎腐病成株期试验中 ,分离自穗腐病的禾谷镰孢菌致病力高于茎腐病的禾谷镰孢菌, 两个病害的轮枝镰孢菌致病力相近 ; 穗腐病试验中 , 两个
5、病害的禾谷镰孢菌致病力差异不大, 而玉米穗腐病的轮枝镰孢菌致病力略高于茎腐病的轮枝镰孢菌。3. 绿色荧光蛋白表达载体的构建及其在镰孢菌中的转化利用无缝克隆技术构建了含有绿色荧光蛋白的具有潮霉素抗性标记载体。应用CaCl2-PEG介导、电转化与农杆菌介导技术, 实现了对玉米茎腐病病菌禾谷镰孢菌与轮枝镰孢菌及玉米穗腐病病菌禾谷镰孢菌与轮枝镰孢菌的绿色荧光蛋白基因标记。转化子在含有潮霉素B 的抗性平板中经五代培养均可以稳定生长并在蓝光激发下发出荧光。 4. 野生型菌株与转化子在生物学表型方面存在异同禾谷镰孢菌在不同 pH的 PDA培养基中野生型菌株较转化子生长速率慢, 但更易产生色素。轮枝镰孢菌野生
6、型菌株与其转化子的生长情况无明显差异。分离自茎腐病与穗腐病的禾谷镰孢菌野生型菌株产孢量均高于其转化子, 而轮枝镰孢菌转化子FV-C79的产孢量与野生型菌株差异不大, 转化子 FV-D108的产孢量高于野生型菌株。在细胞壁降解酶活性存在异同, 其中所有转化子的纤维素酶活性与果胶酶均高于野生型菌株 ; 禾谷镰孢菌转化子的聚甲基半乳糖醛酸酶活性高于野生型菌株,而轮枝镰孢菌转化子的聚甲基半乳糖醛酸酶活性略低于野生型菌株。野生型菌株与转化子在在致病力方面无显著性差异。5. 绿色荧光蛋白标记的镰孢菌对玉米的侵染过程观察通过在荧光显微镜下观察发现 , 接种后的 6-12 h, 分生孢子进行萌发与生长 , 未侵入至种子内部 ,24 h后 , 分生孢子基本已完全萌发 ,48 h 以后 , 菌丝形成网状结构。玉米种子初期萌发时 , 菌丝产生特异组织将寄主表皮穿孔后 , 侵入到寄主内部 , 而后在玉米体内进行定殖以及继续扩展。在整体侵染循环上 , 轮枝镰孢菌可以由根部向上 , 扩展至穗部 , 引发穗腐病病害 , 而由穗部分离的禾谷镰孢菌同样可以引起穗腐病 , 但由茎部分离的禾谷镰孢菌则不能完全扩展造成穗腐病的发生。 将发病籽粒再分离纯化获得的菌株回接玉米种子 , 结果表明 , 在分离获得的镰孢菌仍能够侵染造成发病 , 完成在玉米植株上一整圈的侵染模式。