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1、猪圆环病毒2 型新型疫苗的研制及中和抗体快速检测方法的建立猪圆环病毒 2 型（PCV2）感染导致多种猪圆环病毒2 型相关疾病（ PCVAD）,给全球养猪业造成巨大的经济损失。疫苗接种是预防PCVAD最经济有效的方法。随着免疫压力的加大 ,PCV2病毒在快速进化 , 而现有商业化 PCV2疫苗的疫苗株均是 PCV2a或者 PCV2b基因型 , 其对临床占主导地位的PCV2d毒株的防控效果存有争议。因此研发广谱、高效的PCV2新型疫苗尤为重要。本研究从猪圆环病毒2 型流行病学调查、新型疫苗研制以及疫苗效果快速评估方法的建立等方面入手, 以期为 PCVAD的防控提供必要工具。获得的结果如下 :1.
2、于 2016-2018 年间从全国 65 家猪场的 217 份临床样本中 , 分离获得 48 株PCV2毒株 , 测定其基因组序列并进行PCV2遗传变异与进化分析。48 株 PCV2毒株中 PCV2a、PCV2b与 PCV2d占比分别为 4/48 、13/48 和 31/48 。其中 ,PCV2d亚型在 2016 年、2017 年和 2018 年占比分别为 54.5%、65.2%和 71.4%,表明 PCV2d亚型在我国逐年增加 , 并占有优势地位。48 株 PCV2毒株的基因序列同源性为93.4%-100%。 RDP4.0 软件分析分离的48 株 PCV2毒株 , 未见重组事件。PCV2d的
3、主要抗原表位 (43D/G、115D/G、134N/T、 165P/T、169G/R/S、210E/G/D) 存在较高的氨基酸残基多样性。仔猪攻毒PCV2d HeB-1株后 14、21d 血清中病毒滴度均高于PCV2bLN-3 株 , 但差异不显著（p>0.05 ）。攻毒仔猪的腹股沟淋巴结中PCV2抗原的含量在 PCV2d HeB-1株和 PCV2bLN-3 株之间无明显差异。 2. 将 PCV2 HeB-1株的 ORF2基因与分子佐剂补体C3d-P28进行融合 , 开发出一种新型PCV2 DNA疫苗（ pVOC3）。pVOC3疫苗免疫仔猪后攻毒 , 可显著减少仔猪血清中PCV2b或 P
4、CV2d的病毒拷贝数 , 产生较高的 PCV2特异性抗体 , 并刺激 PCV2特异性干扰素分泌细胞的产生 , 与未加 C3d-P28佐剂的试验组（ pVO）差异显著（ p<0.05）。3. 利用马赛克T- 细胞疫苗设计软件获得PCV2病毒的马赛克 Cap 蛋白 , 其对 66 条参考 PCV2Cap蛋白具有较好的表位覆盖, 与 PCV2 HeB-1株、 PCV2 LN-3株和 PCV2LG株的同源性分别为 98.3%、97.0%、91.8%。马赛克 Cap 蛋白诱骗表位（ 169-180aa）用 Pan DR T 辅助细胞表位替换 , 获得一个改构马赛克Cap蛋白。以 PCV2HeB-1
5、 基因组为骨架 , 将其 Cap蛋白基因用优化的改构马赛克 Cap蛋白基因进行替换 , 新设计的 PCV2病毒基因组全基因合成后进行真核表达载体构建、PK-15 细胞转染及筛选 , 获得一株新型PCV2毒株 , 命名为马赛克 PCV2 SD株。马赛克 PCV2 SD株制成疫苗免疫小鼠 , 小鼠血清中检测不到诱骗抗体, 且与PCV2 HeB-1免疫组相比 , 血清中和抗体水平提高1.6 倍以上。 4. 将含猪干扰素 -基因（PoIFN-）的真核表达质粒转染PK-15 细胞 , 获得一株可稳定表达PoIFN-的 PK-15 细胞系 , 命名为 PK15-PoIFN-细胞系。PK15-PoIFN-细
6、胞可显著增强马赛克PCV2SD株的增殖效率 , 病毒毒价达 1 108.4 TCID50/mL以上 , 且连续传 15 代后对病毒的增殖无影响。 5. 改构马赛克 Cap蛋白经密码子优化后成功实现大肠杆菌高效表达。改构马赛克 Cap蛋白与 Gel 01ST 佐剂乳化制备成疫苗并免疫仔猪 , 免疫后14d 仔猪血清中即可检测到PCV2特异性抗体 , 攻毒后仔猪未检测到病毒血症, 组织病理变化轻微 , 腹股沟淋巴结中PCV2病毒含量很低 ,PCV2特异性 IFN- -SC 的数量显著增加 , 与攻毒对照组相比差异显著（P<0.05）。同时 , 改构马赛克 Cap蛋白亚单位疫苗对PCV2d H
7、eB-1株、 PCV2b LN-3株均能达到保护效果。6. 改构马赛克 Cap蛋白与佐剂乳化后免疫小鼠制备单克隆抗体 , 获得 15株单抗并完成其中 4 株单抗（ 2C5、4G7、5F7、6F8）的鉴定。 4 株单抗均与改构马赛克 Cap蛋白发生特异性反应 , 与 PCV2病毒产生特异性的免疫荧光信号 , 且与 CSFV、PRRSV、PRV、PPV等猪常见病毒无特异性反应。单抗 6F8、2C5为 PCV2的中和性抗体 , 其中单抗 6F8 对 PCV2病毒各基因型均有中和活性 , 而单抗 2C5仅对 PCV2d亚型毒株有中和活性。 7. 以 PCV2中和单抗6F8 为基础 , 制备了一种 PCV2血清中和抗体阻断ELISA试剂盒。以血清中和抗体检测试验结果为标准,PCV2血清中和抗体阻断ELISA 试剂盒的检测敏感性为 98.9%, 特异性为 78.9%, 与细胞中和试验的符合率为93.3%, 批内批间变异系数小于10%,可 4保存 1 年以上。