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1、激光共聚焦显微镜的使用和应用 导读：就爱阅读网友为您分享以下“激光共聚焦显微镜的使用和应用”资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持!Confocal Confocal 共聚焦激光扫描显微镜技术黄娅林 复旦大学上海医学院 医学神经生物学 国家重点实验室Confocal Confocal 技术基本情况介绍 Confocal 工作原理和性能特点 Confocal 样品制作和系统操作 Confocal 技术在科研中的作用 基本情况介绍Confocal共聚焦激光扫描显微镜 Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM, Confocal) 共聚焦激光扫描显微镜在传统荧
2、光显微镜成像 的基础上加装了激光扫描装置，利用紫外或可见激 光激发荧光探针，对生物样品进行断层扫描，结合 计算机对荧光图像进行加工处理观察细胞和组织内 部各个层面或不同侧面的形态变化。 基本情况介绍Confocal特殊结构分辨率提高30%-40% 产生真正意义的三维图像 观察活细胞的动态变化 细胞内离子的动态测量 基本情况介绍Confocal系统构成激光器 扫描装置 荧光显微镜 探测器 计算机 直立或倒置 PMT 系统控制软件 各种应用软件图像储存和输出设备 基本情况介绍仪器简介ConfocalLeica CLSM (1994.5）Leica TCS-SP2 (2004.9) Leica TC
3、S-NT (1997.6)医学神经生物学国家重点实验室 （医学院路138号治道楼801） 基本情况介绍仪器简介ConfocalLeica TCS-SP25 (2007.12)生物医学研究院干细胞研究所 （东安路130号西13号楼410） 基本情况介绍Leica CLSMConfocal显微镜 激光器 基本情况介绍Leica TCS-NTConfocal显微镜Objective type PL FLUOTAR PL FLUOTAR PL FLUOTAR PL APO N PLANDM RBC 直立显微镜Magnification 5x 10x 16x 50x 100x Numeral apert
4、ure 0.12 0.30 0.50 0.75 1.20-0.45 Technique Working distance(mm) 13.1 4.9 0.15 0.12 0.07IMM * W* W* IMM=either water, glycerine or oil * W =water 激光器 Argon (488，514nm) He/Ne 543nm He/Ne 633nm 基本情况介绍Leica TCS-NTConfocal 基本情况介绍Leica TCS-SP2显微镜Objective type HC PL FLUOTAR HC PL APO CS HC PL APO CS HCX
5、PL APO CS HCX PL APO CS HCX PL APO CS * IMM=glycerin or oil 激光器 Argon (488，514nm) He/Ne 543nm He/Ne 633nm 双光子ConfocalDM IRE2 倒直显微镜Magnification 5x 10x 20x 40x 63x 100x Numeral aperture 0.15 0.4 0.7 1.25 1.4 1.4 TechniqueIMM * OIL OIL OIL780-900nm (DAPI、Hoechst、BFP、CFP) 基本情况介绍Leica TCS-SP2Confocal 基本
6、情况介绍Leica TCS-SP5显微镜Objective typeConfocalDMI6000 倒直显微镜Magnification 10x 20x 20x 40x 63x Numeral aperture 0.4 0.4 0.7 1.25 1.4 Technique DRY DRY IMM * OIL OILHC PL APO CS HCX PL FLUOTAR HCX PL APO HCX PL APO HCX PL APO * IMM=glycerin or oil 激光器405nm Laser Argon (458nm，476nm，488nm，514nm) He/Ne 561nm
7、He/Ne 633nm 基本情况介绍Leica TCS-SP5Confocal 工作原理ConfocalLaser Pinhole激光束经照明针孔反射至物镜， 在样品的某一焦平面形成一个点，并 进行扫描。聚焦平面内各个像素点的 荧光强度经探测针孔后由光电倍增管 收集放大，迅速形成高清晰度的荧光 图像。 照明针孔和探测针孔的共轭 显微镜的步进马达装置 工作原理Pinhole与图像的关系Confocal 性能特点一. 横向分辨率比普通荧光显微镜高1.4倍Confocal用抗Tubulin抗体染色的Astrocyte： 非共焦（左）及共焦（右）图像并列显示 性能特点二. 具有连续光学切片功能和Z向观
8、察能力 样品厚度可达500m 深度分辨率为0.1mConfocal扫描模式：xy：观察样品不同层面的荧光强度变化 xz：观察样品沿Z轴的荧光强度变化 性能特点二. 具有连续光学切片功能和Z向观察能力Confocal扫描模式决定了图像的扫描层次。基本上是扫描水平的xy切片或垂直的xz-切片。为建立样品的三维图像，需要在第三维方 向上进行连续的光学切片以产生图像垛。还可以以时间或波长为 第三维坐标进行图像扫描。扫描模式 xyz xzy xt xyt xzt xyzt xy xz xyt xyz 功能 在Z轴方向上进行连续的xy-切片 在y轴方向上进行连续的xz-切片 连续进行多次线扫描 对xy-切
9、片进行连续多次扫描 对xz-切片进行连续多次扫描 以xyz扫描方式对图像垛进行连续多次扫描 在不同的波长下扫描xy切片 在不同的波长下扫描xz切片 在不同的波长下对xy切片进行连续多次扫描 在不同的波长下对xyz图像垛进行扫描 性能特点二. 具有连续光学切片功能和Z向观察能力ConfocalA Series of Image of xy-section Cultured gliocyte of rat brain stained by Fluorescin. 性能特点二. 具有连续光学切片功能和Z向观察能力Confocal 性能特点三. 采用激光照明Confocal探测低对比度或弱荧光信号 通
10、过目镜可直接观察各种生物样品的弱自发荧光 性能特点四. 观察活组织和活细胞的动态变化Confocal四. 性能特点四. 观察活组织和活细胞的动态变化ConfocalDrosophila mitosispre-cellularized embryo GFP-tagged histone, Tubulin: rhodamine 性能特点五. 细胞内各种离子的动态测量和分析Confocal利用激光扫描技术，借以特定的荧光探针，快速、 准确地测定细胞内各种离子含量，包括Ca+ 、 Mg+ 、 Na+ 、 K+ 、 H+以及pH值等。 细胞内游离钙测定 细胞内Ca2+稳态的维持对生命活动是至关重要 的，
11、病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢 紊乱，致细胞坏死和凋亡，测定细胞内钙在生理、 病理和药理学上均具有重要意义。 性能特点五. 细胞内各种离子的动态测量和分析Confocal提供高分辨率二维图像和三维图像Confocal实时动态观察Ca+ 含量变化 准确测定单个细胞内不同部位的Ca+ 含量钙敏荧光探针 激发波长 发射波长 -Quin-2 339 nm 492 nm Indo-1 350 nm 485 nm Fura-2 380 nm 510 nm Fluo-3 490 nm 525 nm Calcium Green 505 nm 530 nm Calcium Orange 505 nm
12、530 nm 性能特点五. 细胞内各种离子的动态测量和分析Confocal 性能特点五. 细胞内各种离子的动态测量和分析ConfocalPhysiology Chart (Time: 10:15:21)Channel 1Int.160.00120.0080.0040.000.00 200.00 400.00 600.00 800.00 sCultured hippocampal neurons of ratFluo-3(AM) 性能特点五. 细胞内各种离子的动态测量和分析ConfocalCa2+-imaging: UV-uncaging Ca-Indicator: Fluo 4, 488 nm
13、 Pancreatic acinar cells 性能特点五. 细胞内各种离子的动态测量和分析ConfocalCardiomyocytes Fluo-3 Ca2+ -sparks and Ca2+ -waves 性能特点五. 细胞内各种离子的动态测量和分析Confocal 性能特点六. 多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像 多通道同步采集图像Confocal研究各种组织和细胞内物质之间的相互关系 共定位（Co-localization）：是指两个或多 个分子（蛋白）完全处于同一空间位置上。 性能特点六. 多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像A BConfocalCD3 Channels (A,
14、 B, C) + Overlay (D) 性能特点六. 多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像Confocal 性能特点六. 多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像ConfocalMouse cerebellar cortex. Hoechst 33258, anti-GFAP/Cy5, anti-calbindin-D28k/Cy3 性能特点六. 多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像Confocal四色荧光标记C. Elegans nervous system, separation of 4 fluorescent proteins: CFP, YFP, GFP, DS RED. Courte
15、sy. Dr. Harald Hutter, MPI for Medical Research, Heidelberg 性能特点七. 荧光和透射光重叠图像观察和分析Confocal用于观察和分析荧光信号在形态结构上的精确定位。 性能特点八. 三维重建和三维显示ConfocalLSCM通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三 维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的 三维效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系， 用以阐明三维结构与组织功能之间的关系。 性能特点八. 三维重建和三维显示 设定Z轴参数 （厚度、步距） 断层扫描Confocal三维软件 （数据重组）A
16、Series of Image of xy-section Three Dimensional Image Obj: 63.0/1.40 OIL Step: 0.40 64-section 性能特点八. 三维重建和三维显示Confocal模拟荧光处理法 (Simulated Fluorescence Press, SFP ) 焦点扩展深度法 (extended depth of focus) 双眼立体图对法 动画旋转法 性能特点八. 三维重建和三维显示 模拟荧光处理法（SFP法）Confocal 性能特点八. 三维重建和三维显示 模拟荧光处理法（SFP法）Confocal 性能特点八. 三维重
17、建和三维显示 模拟荧光处理法（SFP法）Confocal 性能特点八. 三维重建和三维显示 模拟荧光处理法（SFP法）Confocal 性能特点八. 三维重建和三维显示 焦点扩展深度法ConfocalA Series of Image of xy-section Obj: 100/1.2NA WThree Dimensional Image Step: 0.50 34-section 性能特点八. 三维重建和三维显示 焦点扩展深度法Confocal 性能特点八. 三维重建和三维显示 焦点扩展深度法ConfocalSpirogyra crassa Actin: RhodaminePhalloid
18、in Chloroplasts: Autofluorescence 性能特点八. 三维重建和三维显示 双眼立体图对法Confocal 性能特点八. 三维重建和三维显示 动画旋转法Confocal 性能特点八. 三维重建和三维显示 动画旋转法ConfocalDrosophila leg, FITC, projectionSurface rendering 性能特点八. 三维重建和三维显示 动画旋转法ConfocalOne week old larvae DAPI label Two Photon mode, Pulse length 1.2ps, Excitation 780 nm, Obj 2
19、0x PL APO W, NA 0.5 Total thickness: 500 micrometer Stereo Movie 性能特点九. 深入观察原位杂交图像不同层面信息 原位杂交 基因定位 染色体鉴别 检测特定DNA和RNAConfocal优点: 1. 观察同一平面以及各个层面的荧光杂交信号。 2. 提高激光强度、增加探测强度收集弱荧光杂交信号。 3. 对荧光杂交信号进行定位、定性和定量分析以及计 算杂交点数。 性能特点九. 深入观察原位杂交图像不同层面信息Confocal原位杂交+免疫组织化学荧光双标记（基因定位）A. ERCC6 mRNA/FITC (in situ hybridi
20、zation) B. GFAP/Rhodamine (immunohistochemistry) C. Expression of ERCC6 mRNA in Gliocyte (yellow) 性能特点十. 图像处理和分析 平滑处理、降低本底、增强反差 Confocal定性、定位、定量及动态测量和分析 多通道荧光不同强度测量和分析 测量细胞的面积和平均荧光强度等 图像的分屏、重叠、拼接等 图像中标尺、箭头和文字等的插入 性能特点十. 图像处理和分析 平滑处理、降低本底、增强反差 Confocal定性、定位、定量及动态测量和分析 多通道荧光不同强度测量和分析 测量细胞的面积和平均荧光强度等 图
21、像的分屏、重叠、拼接等 图像中标尺、箭头和文字等的插入 性能特点十. 图像处理和分析 平滑处理、降低本底、增强反差 Confocal定性、定位、定量及动态测量和分析 多通道荧光不同强度测量和分析 测量细胞的面积和平均荧光强度等 图像的分屏、重叠、拼接等 图像中标尺、箭头和文字等的插入 性能特点十. 图像处理和分析Confocal 性能特点十. 图像处理和分析Confocal 性能特点十. 图像处理和分析 平滑处理、降低本底、增强反差 Confocal定性、定位、定量及动态测量和分析 多通道荧光不同强度测量和分析 测量细胞的面积和平均荧光强度等 图像的分屏、重叠、拼接等 图像中标尺、箭头和文字等
22、的插入 性能特点十. 图像处理和分析 平滑处理、降低本底、增强反差 Confocal定性、定位、定量及动态测量和分析 多通道荧光不同强度测量和分析 测量细胞的面积和平均荧光强度等 图像的分屏、重叠、拼接等 图像中标尺、箭头和文字等的插入 性能特点十. 图像处理和分析Confocal 性能特点十. 图像处理和分析 平滑处理、降低本底、增强反差 Confocal定性、定位、定量及动态测量和分析 多通道荧光不同强度测量和分析 测量细胞的面积和平均荧光强度等 图像的分屏、重叠、拼接等 图像中标尺、箭头和文字等的插入 样品制作和系统操作Confocal样品固定组织：1. 石蜡切片、冰冻切片 2. 切片厚
23、度 培养细胞：1. 活细胞、固定细胞 2. 活细胞的装置 其它活组织：活的脑片染色免疫荧光组织化学染色法 微量注射法（微量电泳法等） 免疫组化和原位杂交双标记 转染技术 样品制作和系统操作Confocal系统操作开机：显微镜扫描装置计算机系统风扇和激光器 观察：选择滤光片、物镜倍数 (Zoom) 和扫描区域 扫描：预扫描 (z-step, PMT) 断层扫描 处理：储存图像、后期处理和图像分析 样品制作和系统操作实验中需要注意的几个问题Confocal1. 荧光探针的选择： 确定用什么染料染色, 检查其光谱性质, 激发波长, 发射波长, 确信手头有相匹配的CONFOCAL的激光器. 参考: f
24、luorescence.bio- 2. Multi-labelling：合适的激光波长、不重叠的发射光谱 3. 细胞贴壁 4. 样品负载 5. 扫描参数：Laser、PMT、z-step、Section 6. 实验室环境保护和仪器清洁保养 Confocal 技术的作用Leica TCS-CLSMConfocalYi-Ping Yan, neuroreport, 1998, 9(3): 441 446 National Key Laboratory of Medical Neurobiology and Department of Neurobiology, Shanghai Medical U
25、niversityCLSM Leica TCS-CLSMA Confocal 技术的作用ConfocalA. A Series of Image of xy-Section B. Three Dimensional Image (Proj.) A protrusor hypoglossal motoneuron stained intracellularly by Lucifer Yellow. Obj: 10.0/0.45 OIL Step: 4.0 39-sectionBhypoglossal motoneuron/ Lucifer Yellow 5-HT terminals/ Rhoda
26、mine Serial rotations at 10 degree Obj: 63.0/1.40 OILYan Li , Shanghai Instiute of Brain Research Chinese Academy of Sciences Confocal 技术的作用Leica TCS-CLSMConfocalCA1 pyramidal cell in rat hippocampal slice labeled by Fluo-3(AM) in situ. Obj: 63.0/1.4OILLiu-Hua Wang Acta Physiologica Sinica, 1998,50
27、(3): 355 358 State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Shanghai MedicalCollege of Fudan UniversityCultured Vessel Endothelial Cell of Human Umbilicus (Fluo-3). Obj: 40/1.30 OIL Zoom: 2.1Zhong-Xiang Yao,第三军医大学学报, 1998,20 (3): 205 207Department of Histology and Embryology, Third Military Universit
28、y Confocal 技术的作用Leica TCS-NTConfocalAnalysis of surface expression of DOR in NG108-15 cells. 12CA5/FITC Obj: 100x/1.2NA WZhao Jing, BBRC, 1997, 283(1): 71 76 State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Shanghai Medical College of Fudan University Confocal 技术的作用Leica TCS-NTConfocalABCCR5(A)/CXCR4(B
29、), 12CA5/FITCTCS/Texas RedColocalization of TCS with Chemokine receptors on HEK293 cells surface.Jian Zhao, J.Exp.Med. 1999, 109(1): 101111, Shanghai Institute of Cell Biology and Shanghai Research Center of Life Sciences, Chinese Academy of Sciences Confocal 技术的作用Leica TCS-NTConfocalHCV antigen exp
30、ress in nucleus and cytoplasma of HCC. (Obj: 100x)HCV antigen express extensively around of HCC (Obj: 10x)Wang-Hai Zhang, Chinese Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 1999, 8(2): 211 215 Division of Pathology, Shanghai Medical College of Fudan UniversityYoYo-1 iodide stains nuclei in paraffi
31、n tissue section. Cy3 stains HCV antigen. Confocal 技术的作用Leica TCS-NTA BConfocalThree-dimensional view of spindle cell HCC (A) and tubular adenocarcinoma of HCC (B). YOYO-1 iodide Obj: 50x/0.75NA WWang-Hai Zhang, World J Gastroentero 2000, 6(3): 344 347 Division of Pathology, Shanghai Medical College
32、 of Fudan University Confocal 技术的作用Leica TCS-NTConfocalNeuropeptide Y/FITC Estrogen receptor/TRITC Expression of estrogen receptor in neurons of rat brain(yellow). Obj: 50x/0.75NA WFei Sun, P.S.E.B.M. 2000; 223: 295 301 Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Obstetric and
33、 Gynecologic Hospital, Fudan University Confocal 技术的作用Leica TCS-NTConfocalGFAP positive cells (Mller cells)/FITC GABA transporter/Texas Red Expression of GABA Transporter subtype2 on Bullfrog Retinal Mller Cells. Obj: 50x/0.75NA WJing-Wei Zhao, GLIA 2000; 31: 104 117 Shanghai Institute of Physiology
34、, CAS Confocal 技术的作用Leica TCS-NTConfocalContralateralExpression of EAAT1 in astrocytes of rat cerebral cortex(yellow). Expression of EAAT1 in neurons (green) and astrocytes(yellow) after hypoxia-ischemia. EAAT1/FITC GFAP/Rhodamine Obj: 50x/0.75NA WF.TAO, Neuroscience, 2001, 102 (3): 503 513 National
35、 Key Laboratory of Medical Neurobiology, Shanghai Medical College of Fudan UniversityIpsilateral Confocal 技术的作用Leica TCS-NTConfocalVEGF/FITC GFAP/RhodamineNSE/FITC VEGF/RhodamineZeng-Jin Yang, Wei-Li Bao, Journal of Neuroscience Research 2002, 70: 140 149 National Key Laboratory of Medical Neurobiol
36、ogy, Shanghai Medical College of Fudan University Confocal 技术的作用Leica TCS-NTConfocalBCDFGHJian-Yi Xu, Neuroscience, 2003, 118: 59 67 National Key Laboratory of MedicalNeurobiology, Shanghai Medical College, Fudan University Confocal 技术的作用Leica TCS-NTConfocalJia-Li Li, Journal of Biological Chemistry
37、, 2003, 278(32): 3021930226 National Laboratory of Medical Neurobiology, Shanghai Medical College, Fudan University Confocal 技术的作用Leica TCS-NTConfocalShuiyun Lan, FEBS Letters, 2003, 554: 289294 Key Laboratory of Medical Molecular Virology, Shanghai Medical College, Fudan University Confocal 技术的作用Co
38、nfocal Confocal 技术的作用Leica TCS-NTConfocalbFGF/FITC nuclei acid/Radiant Red GFAP/Cy5 Expression of bFGF-like IR in frontoparietal cortex. Obj: 50x/0.75NA WWei OuYang, ACUP. & ELECTRO-THERAP.RES, 1999, 24: 1 10 State Key Laboratory of MedicalNeurobiology, Shanghai Medical Collegeof Fudan University Co
39、nfocal 技术的作用Leica TCS-SP2ConfocalGFAP/Rhodamine NeuN/FITC XPB/Cy5 Hoechst 32258F-actin/Phalloidin Tublin/ Texas RedTRS/DTAF INS/Cy3 DAPI Confocal 技术的作用ConfocalAutofluorescence1 Blood Vessal Wall Intima(I), Media(M),Intimal Elastic Lamina(IEL) Obj: 10x/0.3NA dry Wang-De Dai, Zhongshan Hospital, Fudan
40、 University2Aortic Wall in the AnimalModel of Takayasus Arteritis. Obj: 50x/0.75NA W Zhi-Peng Hong, Zhongshan Hospital, Fudan University3Human Paralacrimal Gland Obj: 16x/0.5NA IMM Hong-Ping Chui Eye、Ear、Nose & Throa Hospital, Fudan University Confocal 技术的作用ConfocalAutofluorescenceJian-Xin Xie Depar
41、tment of Anatomy , Shanghai Medical College of Fudan University Intestinal Mucosa of Human Obj: 5x/0.1NA Obj: 50x/0.75NA W Zoom: 2.0 Mucosa Layer of Intestinal Tract Vessel in Intestinal wall Obj: 5x/0.1NA Obj: 50x/0.75NA W Zoom: 2.0State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Shanghai Medical College of Fudan UniversityAB Confocal 技术的作用Confocalz 对科研项目的支撑作用国家973项目 国家863项目 国家自然科学基金重点项目 上海市重大基础研究项目 Confocal 技术的作用Confocalz 对科研论文和成果的支撑作用国家自然科学奖、部委级科技奖、全国百篇优秀博士论文 以及其他等级奖励 Confocal 技术的作用Confocal提升了项目竞争能力 提高了科学研究水平 获得高质量研究成果Confocal生物秀专心做生物Italy Roma百度搜索“就爱阅读”,专业资料,生活学习,尽在就爱阅读网,您的在线图书馆 92