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1、1,第八章 人工种子,人工种子概述,繁殖体种类及其培养技术,人工种子制备,人工种子研究及应用前景,2,第一节 人工种子概述,人工种子(artificial seeds)亦称体细胞种子。 早期的人工种子概念是：体细胞胚经过人工种皮包被后而形成的体细胞种子。 任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。,3,根据包被的程度可将人工种子分为三大类： 裸露的或休眠的繁殖体 如微鳞茎，微块茎等。它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率。 人工种皮包被的繁殖体 一些体细胞胚、原球茎等不能过度干燥，但只需要用人工种皮包被即可维持良好的发芽状态，如胡萝卜体细胞胚。 水凝胶包
2、埋再包被人工种皮的繁殖体 大多数体细胞胚、不定芽、茎尖等均需要先包埋在半液态凝胶中，再经人工种皮包裹才能避免失水，从而维持良好的发芽能力。,根据繁殖体的类型可分为两类： 一类是体细胞胚人工种子； 另一类是非体细胞胚人工种子,据报道，目前已对26个科，36个属的植物进行了人工种子研究。其研究范围显示出两大特点： 一是重要经济作物和粮食作物的人工种子报道日益增多； 二是以微器官为繁殖体的报道日益增多，其中包括微芽、微枝、原球茎、小鳞茎、小块茎等。,4,在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种性，又可以使之具有实生苗的复壮效应； 可以对优异杂种种子不通过有性制种而快
3、速获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有主要的适用意义； 对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体、非整倍体、工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应用； 与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险； 与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。,5,马铃薯试管块茎人工种子,试管块茎人工种子田间种植,6,第二节 繁殖体的种类及其培养技术,繁殖体是人工种子的主体，早期的研究认为，体细胞胚是人工种子制备的最佳繁殖体。 以体细胞胚作为繁殖体并不适用于所有的植物：遗传变异更大；许多植
4、物的体细胞胚诱导十分困难。 微器官作为人工种子繁殖体的报道日益增多。 1990年，有关人工种子的报道以体细胞胚为繁殖体的占63.6%，以芽为繁殖体的报道占36.4%； 1994年，以体细胞胚为繁殖体的报道则只占48.8%，以芽为繁殖体的占38.1%，另有13.1%为其它类型的繁殖体。,7,不同类型繁殖体比较,繁殖体生产,8,一不同繁殖体的比较,体细胞胚 形成需要经过至少两个阶段： 第一阶段，在含高生长素浓度的培养基中，诱导培养胚性细胞； 第二阶段，在较低生长素或无生长素的培养基中形成体细胞胚。,9,微芽 发生一般只需一个培养程序，但有时为了增加繁殖体的数量，也需进行一定次数的继代。 微型变态器
5、官 块茎、块根以及鳞茎、球茎类的繁殖体产生可能需要经过不同的诱导程序。,10,部分植物繁殖体诱导培养条件 （引自陈正华等，1998 ）,芥菜 型油菜,11,不同繁殖体成苗所需时间及成株率（引自陈正华等，1998 ）,12,二. 繁殖体培养技术,体细胞胚培养,微型变态器官培养,微芽繁殖体培养,13,体细胞胚规模化生产,作为人工种子繁殖体的体细胞胚，其基本要求是要具有发育上的同步性，还必需满足如下标准特征： 其一，形态正常，具有完整的胚结构； 其二，与母体植物的基因型基本相同，特别是在重要经济性状和农艺性状上没有变异； 其三，具有较好的成熟性，能耐一定程度的脱水。,14,其次，作为实用化的体细胞胚
6、种子还必需满足一定的数量需求，规模化生产是其基本前提。 Choi等（2002）建立了人参体细胞胚大规模液体培养体系，每500ml容器可生产体细胞胚12,000个。在体细胞发育至子叶期早期，将其转入二分之一MS无机盐附加9%蔗糖浓度的培养基中诱导加入休眠，获得了良好效果。 其它一些植物如芹菜、苜宿等体细胞胚的批量化培养也取得类似结果。,15,微型变态器官繁殖体的培养,光照：能够形成变态器官的植物常常具有光照周期上的双重需要， 光照强度亦是影响变态器官形成的重要因素之一。 温度：离体培养诱导变态器官形成时，必需充分考虑自然条件下该植物变态器官产生所需要的温度条件。 培养基蔗糖浓度：现有研究资料显示
7、，培养条件下的变态器官形成与培养基的蔗糖浓度有关，较高的蔗糖浓度对于一些植物的微型变态器官形成似乎是必要条件。 激素：植物变态器官的形成常常发生在内源激素发生某种变化以后，外源激素的调控主要通过内源激素的变化而起作用，而不同培养条件下的内源激素水平又具有很大差异。,16,芽繁殖体的培养,大多数情况下，微芽、不定芽的培养往往直接从外植体上直接诱导形成，培养方式简单，且勿需高浓度的激素处理，因此所产生的繁殖体基本保持了原有植物的品种特性。 根据植物类型不同，可选取不同的外植体类型作为芽产生的来源，如非洲紫罗兰一般选用叶片为外植体，诱导不定芽作为微繁殖体；榆树类植物则可选根作为外植体产生微芽；石竹类
8、花卉可以茎尖为外植体培养侧芽作为繁殖体。,17,第三节 人工种子包被,繁殖体预处理,繁殖体包埋,人工种皮装配,18,一繁殖体的处理,体细胞胚形成后，需要在无激素培养基上经过一定阶段的后熟培养，然后进行脱水干燥，再将畸形胚选出后才能进行包埋。在脱水之前用ABA处理体细胞胚强迫其进入休眠，更有利于长期贮存。 微型变态器官繁殖体不能过度脱水，但亦需要适当干燥，除去表面及多余的水分，同时要进行表面消毒处理以繁殖包被后的感染。为了延长贮存时间，亦需根据使用季节进行适当的休眠处理。 芽为繁殖体的类型，则不能进行脱水处理，但必需筛选生长健壮、组织充实的芽进行包埋。,19,二繁殖体的包埋,包埋介质的要求： 首
9、先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，并具有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输和种植操作中的安全。 同时，它最好能够提供类似于胚乳的营养物质，以供繁殖体发芽的需要。 此外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生物感染危害，因此介质中还应含有适当的杀菌剂。,常用的两种人工胚乳液配方： MS（或SH、White）培养基加入1.5%的马铃薯淀粉水解物； SH（0.5）培养基加入1.5%的麦芽糖。,20,几种植物人工种子的附加成分及成苗率（引自陈正华等，1998 ）,21,以海藻酸钠作包埋剂的操作程序是： 在配制好的海藻酸钠溶液中，按一定比例加入繁殖体并混匀。 将其逐滴滴入2.0%-2.5%的C
10、aCl2溶液中，经2030min.的离子交换作用即形成含有繁殖体具有一定刚性的人工种子， 用无菌水漂洗20min.以终止反应。,图5.5 多头自动人工种子包被系统示意图。 1.双活塞泵；2. 灭菌器； 3.加湿器； 4. 振动器； 5. 脉动腔膜；6. 同轴沟； 7. 脉动腔； 8. 喷碟； 9. 旁路系统； 10. 反应池；11. 搅拌子；12. 硬化溶液及其输入。 （引自Brandenberger和Widmer，1998）。,22,番木瓜体细胞胚人工种子（Castillo等，1998）； b. 马铃薯微芽人工种子（Patel等，2000）； c. 人参体细胞种子（Choi和Jeong，20
11、02）。,23,三人工种皮的装配,理想的人工种皮应该是： 具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成分不易流失，同时又具有良好的透气性。 具有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储运性和适于机械化操作。 无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽。 配制简单易行，成本低。,24,常用的人工种皮材料 早期使用Elvax 4260涂膜，价格昂贵，操作复杂、包裹效果不尽人意。 新近试验使用的二氧化硅化合物材料包括疏水的Tullanox和微亲水的Cab-O-Sil，二者均可以粉末状包裹在人工种子胶囊外层，操作时只需将胶囊在上述材料中滚动即可完成包被过程，操作简单易行，大量生产还可以机械化操作。 最近还报道一种硅酮种衣
12、，它不仅可以抗真菌，而且可渗入水蒸气和氧气，这些材料均还处于试验之中。,25,第四节 人工种子实用化的策略,陈正华等（1998）对人工种子的应用提出了如下策略： 微器官人工种子可能最先用于无性繁殖植物 微器官人工种子可用于天然种子繁殖后代群体变异大的植物 以体细胞胚为繁殖体应用的可能性及需要注意的问题,26,一微器官人工种子可能首先用于无性繁殖植物,微器官如微芽，试管块茎、试管鳞茎等作为繁殖体时，成苗率高且出苗整齐一致，具有田间应用的可行性，同时,离体培养的繁殖体可完全去除病原物，因而已越来越多地用于无性繁殖种苗生产中。 传统上的试管苗由于体积大、对携带储运条件要求苛刻因而限制了使用规模。如果
13、利用人工种子将有可能首先实现无性繁殖植物种子生产的彻底革命。 以微芽为繁殖体的人工种子技术，有可能首先在无性繁殖的果树、花卉、林木等植物中得以应用。,27,马铃薯人工种子应用,28,二微器官人工种子可用于天然种子繁殖后代群体变异大的植物,有些植物如桉树，虽然能够用天然种子繁殖，但种子繁殖的植株群体变异大，树体不整齐。 不定芽试管苗繁殖技术已在生产上显示了树体整齐的优越性，目前以微芽为繁殖体的人工种子技术已经建立。 桉树人工种子在土壤中的成苗率已可达80%以上，且树体十分整齐。,29,三以体细胞胚为繁殖体应用的可能性及局限性,花或果实为经济产品的多年生植物如果树等，有可能出现较长的幼年期，使开花结果推迟，且还可能出现果实不整齐的现象。 以营养器官或木材为产品的植物中，以及在以改善生态环境、保护濒危树种或对性状一致性要求不严格的植物中，体细胞胚繁殖体则具有其它繁殖体不可替代的优越性。,