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1、1,基础生物技术Basic Biotechnology,第八章 特定应用 人类健康和检验,2,第一节,医学应用 (application in medicine),3,学习目标,本章将会学习到： 1. 生物技术在人类健康问题典型应用 2. 生物技术在人类健康问题主要应用,4,基因治疗,基因治疗(gene therapy)指的是正常基因替代缺陷基因以矫正遗传疾病的分子生物科技, 其程序与基因剔除(gene knockout)技术相反,包括: 1)替代治疗(replacement therapy): 需要添加完整的基因于病人基因组中以补足缺陷基因 2)标的基因修复(targeted gene re
2、pair): 不干扰DNA上的基因调节, 修复后细胞能回复原来的功能,5,基因治疗的类型,基因治疗分成两种: 1)体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy): 此种操作仅限于体细胞, 不能遗传给后代 2)生殖细胞基因治疗(germline gene therapy): 针对生殖细胞和性细胞(精子和卵子)操作,可遗传于后代,6,基因治疗的方法,矫正生物缺陷基因有两种方法: 1. 离体基因导入后进入体内(ex vivo)： -离体基因导入后进入体内的策略是将病人的细胞于实验室操作后，将改善之细胞殖回病人体内,7,基因治疗的方法,2. 活体内(in vivo) ： -活体内
3、基因治疗是利用基因传递系统(例如：载体或脂质体liposomes)将矫正基因直接殖入体内,8,基因治疗工具,基因治疗工具是基于传输系统与序列运送 1)病毒传递系统： -此系统包含四种类型，分别为逆转录病毒(retroviruses) 、腺病毒(adenoviruses)、腺结合病毒(adeno-associated viruses)和慢病毒(lentiviruses)等 2)标的基因修补工具： -包括三股型寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotides) 、同型组合(homologous recombination)和目标病毒基因(viral gene target
4、ing),9,基因治疗工具,目前用于基因疗法的方法为藉由病毒载体送入，其优点在于转殖效率佳，表现可能较好，而缺点却在于其潜在性的危险 非病毒载体方法就恰好相反，虽然其安全性较高，比较没有副作用，但其转殖效率及表现基因方面可能都有很大的限制,10,病毒传递系统,11,三股型寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotides)TFO,三股型寡核苷酸是由单股DNA分子与其所能辨识的完全或几乎完全相同的双股DNA结合，并进一步形成三股结构 此技术有两种方法： 1)具有缺陷基因的矫正序列之寡核苷酸结合双股DNA片段，因此取代缺陷基因 2)将寡核苷酸单独使用，于三股型寡核苷酸形成后
5、会破坏突变基因的活性,12,三股型寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotides)TFO,13,三股型寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotides)TFO,14,同型组合(homologous recombination),同型组合也称为小片段同型更换(small fragment homologous) ，利用染色体间DNA小片段的交换发展细胞之能力，以正确核苷酸序列取代具有缺陷基因 此片段与错误位置之基因序列互补，完成后会形成合成寡聚合物，因而启动细胞DNA的修补机制,15,16,目标病毒基因(viral gene targetin
6、g),部分正常基因被插入于单股DNA病毒并转型入宿主基因组中，于插入基因组后，宿主细胞会利用出入基因修补基因组中错误的部份,17,18,基因治疗的状况,基因治疗最早的案例发生于法国，其为应用基因治疗于腺苷酸去胺酶(adenosine deaminase; ADA)缺乏症的病人，此种疾病为基因缺陷影响所编码之酵素，造成自体性退化型严重免疫不全(SCID) ，严重者会造成死亡 基因治疗方式为将病人的T细胞次族群分离并与携带ADA基因载体混合，经病毒感染后，于实验室中培养T细胞，确定目标基因具活性在注入病人体内,19,基因治疗的状况,目前已应用于基因治疗的疾病包括囊性纤维化、Duchene肌肉萎缩症
7、(遗传性疾病)及家族性高胆固醇症 基因治疗在单一基因疾病较适用，但大部分的疾病并非单一基因所造成 基因治疗离成功还很遥远，目前基因治疗上无法适用于生命中不能复制细胞(如神经细胞) 基因治疗的费用而贵，谁该进行?该不该进行?,20,基因治疗的挑战,基因治疗发展缓慢的原因为： 1. 了解基因功能(understanding gene function)： 2. 基因传输(gene delivery)： 3. 多基因特性(multigenic traits)： 4. 成本高(high cost)：,21,DNA/RNA疫苗(DNA/RNA Vaccines),疫苗是用以保护身体免于受到侵害, 需要再
8、感染前施用且在不同期间具不同程度之防御效果 重要的疾病: -完全扑灭(天花) -减少病例(A型肝炎,B型肝炎,麻疹,斑疹伤寒症及破伤风),22,免疫反应,免疫系统如何运作？ 抗原：为一种造成免疫反应的分子，一般为蛋白质、蛋白质片段及多醣体，对于病原具有特异性 主动免疫(active immunity)：宿主因自然感染或人工预防接种而具后天性免疫力 被动免疫(passive immunity)：使用抗体 疫苗是一种抗原剂，注射入血液中，可以刺激免疫系统合成抗体，以保护身体免于感染,23,Humoral Immunity (Antibodies),24,25,传统疫苗,一般传统疫苗是利用杀死或部分
9、变弱的病原菌来制备，以诱导宿主免疫系统产生抗体攻击所察觉的入侵者 由死的病原所制造：A型肝炎与小儿麻痹疫苗 由病原中分离抗原：B型肝炎次单元疫苗 减毒活疫苗：具有双重活性，且有能力透入细胞以诱导杀手细胞攻击，包括麻疹、腮腺炎、德国麻疹、小儿麻痹及天花等疫苗,26,27,28,29,基因疫苗,基因疫苗(genetic vaccines)是在质体上插入一个或两个抗原蛋白基因，且经基因重组使其不具致病力 以重组蛋白质方式生产疫苗：分离病毒鞘壳上某一种蛋白质的基因，再利用重组技术，表现成重组蛋白质，则此重组蛋白质将可作为疫苗可用,30,31,32,33,34,人类基因体计划,生物科技在人类健康上应用之
10、一为基因组学-结构基因组与功能性基因组 后-基因体学：知道序列之后，开始研究这些序列的功能性 基因体学 蛋白质体学 醣类体学,发现基因,解读基因功能,35,DNA文件,DNA文件可展现个体特殊的详细基因型态，并可应用于不同的诊断与鉴定 -遗传性疾病的检验 -遗传谘询 生物技术应用于遗传性疾病检验有两个阶段： -未出生前：检验为决定胚胎或胎儿的遗传疾病 -未发病前：症状前筛选，诊断过程可于疾病症状出现前的任何时间下进行,36,遗传性疾病的检验,于胚胎或胎儿的遗传疾病，传统的检验为羊膜穿刺法或绒毛采样 羊膜穿刺为从胎儿四周收集羊膜液体，此试验通常不能用于怀孕期第15或第16周前，细胞可经培养以进行
11、核型分析与生化缺陷分析，且可测试是否罹患生化疾病 绒毛采样在怀孕约8-10周即可进行,37,38,遗传谘询,遗传谘询是运用检测结果提供多种信息，协助客户面对遗传病诊断结果以做出正确的选择 简单地说便是由患者或其亲属提出有关疾病的问题，由医生或医学遗传学专业人员就该病的病因遗传方式诊断治疗和预测，以及患者同胞、子女再患此病的风险等问题，进行解答的医学实验，又称遗传商谈。而其主要目的是在防止遗传病和避免缺陷儿的出生，它更是优生的重要内容之一,39,个体基因药理学,药物疗法已广泛地使用于治疗生理疾病原性不同之疾病，但不同的生物个体对于单一药物的反应是不同的，某些药品甚至会有不良的影响 个人化药物治疗
12、为较安全的方法：影响因子包括年龄、营养及一般健康状况,40,个体基因药理学,将具有相关疾病表现行之群组患者分成次群组，依据群组织次群特性给予药物处方，以增进药物效能与降低毒性，优点包括：改善医师处方、专一性对偶基因核苷酸及药物发展 专一性对偶基因寡核苷酸(allele-specific oligo-nucleotides; ASO)为一种能与只有一个核苷酸差异序列杂交之专一性碳针，正常与已知基因突变之核苷酸序列疾病可利用ASOs筛检出异常者,41,42,单一核酸多样性(single nucleotide polymorphisms；SNP),SNPs最早发现的例子是在1919年即发表的ABO血
13、型，直到1993年才了解这是一个基因的三种不同的alleles 这是人类个体与种族之间差异的来源 会造成外观高矮、胖瘦之类的明显差异，更可能隐含某种易感染的疾病，或对药物的差别反应等等 目前资料显示大约每1.91kb就存在一个SNP,43,干细胞,干细胞(stem cells)是一群尚未完全分化的细胞 动物干细胞具无限分化能力并可形成特化细胞，如同植物的愈合组织 干细胞能分化成多种结构(例如血液干细胞产生与血液相关细胞，如血小板、红血球、白血球等) ，因而具有多能性,44,45,46,47,48,产生多功能性的干细胞,人类胚胎干细胞发现于1998年，科学家可由几个来源来获得干细胞： -在活体外
14、授精的胚胎：分离自人类胚胎内部细胞块 -发育不全胚胎：为终止怀孕妇女的胚胎，堕胎或死胎 -体细胞细胞核转移：卵细胞去除细胞核之后，与另一个体细胞融合而产生全能细胞,49,50,成体干细胞,成体干细胞来自于一些成体组成，但一些组织干细胞仍不能成功分离 成体干细胞的利用受到一些因子限制，包括数量太少及离心分离纯化困难，如果是遗传性疾病，成体细胞也可能有缺陷而不能使用 成体干细胞在培养一段时间后会失去分裂和分化能力，并不适于医学上使用 成体细胞只会与胚胎细胞融合，变成染色体数目比正常细胞还多的巨大细胞,51,52,多功能性干细胞的应用潜力,为何干细胞极具潜力? 1. 有助于了解生物发育期间的相关机制
15、，了解先天性疾病与异常细胞分裂及细胞特化发生之关连性 2. 多功能性干细胞可作为医药临床前试验中不同类型细胞之初期试验 3. 多功能细胞发展成分化细胞，以取代损伤细胞和组织，并减少器官和组织移植的需要,53,人类胚胎干细胞?,黄禹锡没有如他在2004年所声称的那样克隆成世界第一个人类胚胎 经最终检验结果证实，并不是与患者体细胞基因相同的干细胞,54,55,一旦干细胞自我更新的控制机制遭到移除，结果将和癌症的情况相像,一直以来，我们都是干细胞为万灵丹，却没想到它竟可能转变成癌细胞，目前已知有几种癌症与干细胞有关，想要根除这类癌症，可能先摧毁这些飘忽的凶手 目前已经有数种血液癌症和实心肿瘤，证实由
16、癌症干细胞所引起的 肿瘤生长有由一小群类似干细胞的癌细胞所造成,56,57,饲养动物提供器官与细胞,异体移植(xenotransplantation)为异种饲养动物主要器官(例如心与肺)可移植于人体 早期的报告是将猪的细胞转殖入人体，为何选择猪? 大小、容易饲养和照顾 猪会携带类病毒-猪内生性转录病毒，此病毒可被传递入人体细胞中及猪抗原半乳糖(Gal)易加速免疫排斥,58,第二节,法院上的应用,59,学习目标,本节中可学习到: 1. DNA于法院上的应用 2. 科学上的DNA文件,60,什么是DNA文件?,DNA文件(DNA profiling)是将DNA应用在检验用途，藉以描绘样品DNA并与
17、其它已知特性的样品做比较，可应用于健康维护、司法系统与其他方面 健康维护上的应用，遗传疾病之诊断，以预测个人因亲代遗传疾病而罹患之概率 司法系统上，使用DNA文件来辨认犯罪事件的嫌疑犯或亲族关系的争议(1994年桑普森杀妻案及辜振甫私生女),61,法庭侦防用的DNA来源,从人体的任一部分皆可获得DNA，如血液、唾液、体液及尿液 细胞核与粒线体DNA两种皆可使用，但因mtDNA含量较高，因此较可能恢复古老样本的生物品系 mtDNA可经由母系遗传，因此可解决可提供未知女性的亲源关系,62,分析方法,RFLP与PCR技术可以用于DNA文件，传统DNA文件分析需利用变异数串连重复序列(Variable
18、 Number Tandem Repeats; VNTRs) DNA技术的成功有赖于基因组片段的鉴定，音可以使用于族群中单独个体的区别 不同个体基因组最常发生之变异区序列串列称为小卫星基因(minisatellites)，由2-100个核苷酸组成，通常为GC-rich,63,小卫星基因(minisatellites),小卫星基因(minisatellites)序列的特性为在两个内切酶切位间具有纵向重复排列的DNA序列 GGATGGATGGATGGATGGAT 每一串序列中重复的次数约为2-100，此种重复的核苷酸部分称为变异数串连重复序列 一基因座重复区域是多变性的(10%)，为多型性区域 许
19、多家族之对偶基因皆有VNTR对偶基因，VNTR之杂异性是普遍的,64,65,66,67,变异数串连重复序列(Variable Number Tandem Repeats; VNTRs),应用RFLP技术，核酸内切酶是可以辨识VNTRs两侧序列，再以电泳及南方墨点法之RFLP标准操作流程可呈现不同样品VNTRs之差异 由于同一个体的任何组织中所得之DNA具VNTRs类型是相同的，此分析法只需要少量的样本即可,68,以PCR扩增DNA文件(PCR-based DNA profiling),目前DNA文件采用PCR与短纵排重复序列(short tandem repeats, STRs)，STRs为短
20、(2-4)VNTRs，STR位置较VNTRs具有较少的对偶基因 1999年美国使用10个STR基因座，保证10亿个体中有少于一个具有相同的结果 FBI目前使用13个STR基因座位置来提高其样本有相同DNA文件的概率,69,利用RFLP(restriction fragment length polymorphism)与PCR的DNA文件,RFLP为DNA文件利用自然发生具有高度差异性(每个基因座上有许多对偶基因)的VNTRs，因此两个不相关个体具有相同DNA文件是非常不可能的 此技术的缺点为需要相当质量的DNA及电泳时所造成不同的结果判读，如斑转移(band-shifting)为相同的片段于胶
21、片上迁移的距离不同，因此需要藉助其它方法来确认(单型探针monomorphic probe),70,71,72,利用RFLP与PCR (polymerase chain reaction)的DNA文件,以PCR为基础的DNA文件为快速且省钱的技术，但准确度较低 PCR只须少量的样本，但是也因此可能造成增幅过程中引起的对偶基因中断(allele dropout) 当DNA样本过度分解的状况之下，只能选择以STR分析 PCR是非常灵敏的技术，而在污染物中所存在的微量未知成分可能会阻碍增幅的程序,73,DNA文件结果解释的陷阱,实验室检验的过程当中，DNA文件的解释可能因为操作上或解读上的差异而发生错误 若嫌疑犯与受难者的文件未能符合可能可以排除涉案人；但确定的比对未必可以证明嫌疑犯是犯罪的犯人，可能有其他具相同DNA文件的人 DNA文件一般用到的范围是父子关系的争议或是血缘关系的分析,74,DNA文件的应用,DNA文件在同一家族中,每一个基因座上对偶基因相同的可能性为25%; 若采用4个基因座,两个家属具相同对偶基因的可能性至少0.4%, 因此可以用来鉴别相同家族不同成员的案情 粒线体DNA也可以当作DNA文件，其由母系遗传而来，两个体是否有关联，可通过母亲的血缘而得到mtDNA序列相似度加以分辨,