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1、RNA 的提取和cDNA 合成原理和实验方法第一节 . 概述从真核生物的组织或细胞中提取mRNA, 通过酶促反应逆转录合成cDNA 的第一链和第二链 ,将双链 cDNA 和载体连接 ,然后转化扩增 , 即可获得 cDNA 文库 ,构建的 cDNA 文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较 cDNA和相应基因组DNA 序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70 年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的
2、基本步骤包括用反转录酶合成cDNA 第一链 ,聚合酶合成cDNA 第二链 ,加入合成接头以及将双链DNA 克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。一.RNA 制备模板 mRNA 的质量直接影响到 cDNA 合成的效率。由于 mRNA 分子的结构特点 ,容易受 RNA 酶的攻击反应而降解 ,加上 RNA 酶极为稳定且广泛存在 ,因而在提取过程中要严格防止 RNA 酶的污染 ,并设法抑制其活性 ,这是本实验成败的关键。 所有的组织中均存在RNA 酶 ,人的皮肤、 手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套） 。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤2 小
3、时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC) 水溶液处理 ,再用蒸馏水冲净。 DEPC 是 RNA 酶的化学修饰剂 ,它和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。 DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用 DEPC 处理 ,加入 DEPC 至 0.1% 浓度 ,然后剧烈振荡 10 分钟 ,再煮沸 15 分钟或高压灭菌以消除残存的 DEPC, 否则 DEPC 也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA 活性。但 DEPC 能与胺和巯基反应 ,因而含 Tris 和 DTT 的试剂不能用DEPC 处理。 Tris 溶液可用
4、DEPC 处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用 DEPC 处理水配制 ,并尽可能用未曾开封的试剂。除 DEPC 外 ,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA 酶抑制蛋白等。此外 ,为了避免 mRNA 或 cDNA 吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经 硅烷化 处理。细胞内总 RNA 制备方法很多 ,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA 提取试剂盒 ,可快速有效地提取到高质量的总RNA 。分离的总 RNA 可利用 mRNA 3末端含有多聚 (A)+的特点 ,当 RNA 流经 oligo (dT) 纤维素柱时 ,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在
5、 oligo(dT) 纤维素上 ,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次 oligo(dT) 纤维素柱 ,可得到较纯的mRNA 。纯化的 mRNA 在 70%乙醇中 -70可保存一年以上。二.cDNA第一链的合成所有合成 cDNA 第一链的方法都要用依赖于RNA 的 DNA 聚合酶 (反转录酶 )来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV) 逆转录酶和从表达克隆化的Moloney 鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒 (MLV) 反转录酶。 AMV 反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性
6、包括依赖于 RNA 的 DNA 合成 ,依赖于 DNA 的 DNA 合成以及对 DNA:RNA 杂交体的 RNA 部分进行内切降解 (RNA 酶 H 活性 )。 MLV 反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于 RNA 和依赖于 DNA的 DNA 合成活性 ,但降解 RNADNA杂交体中的RNA 的能力较弱 ,且对热的稳定性较 AMV反转录酶差。 MLV 反转录酶能合成较长的cDNA( 如大于2-3kb) 。AMV 反转录酶和MLV 反转录酶利用RNA 模板合成 cDNA 时的最适 pH 值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。AMV 反转录酶和 MLV 反转录酶
7、都必须有引物来起始DNA 的合成。 cDNA 合成最常用的引物是与真核细胞mRNA 分子 3端 poly(A) 结合的 12-18 核苷酸长的 oligo(dT) 。三.cDNA 第二链的合成cDNA 第二链的合成方法有以下几种:1. 自身引导法 合成的单链 cDNA 3端能够形成一短的发夹结构 ,这就为第二链的合成提供了现成的引物 ,当第一链合成反应产物的 DNA:RNA 杂交链变性后利用大肠杆菌 DNA 聚合酶 Klenow 片段或反转录酶合成 cDNA 第二链 ,最后用对单链特异性的 S1 核酸酶消化该环即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用 S1 核酸酶切割发夹结构时无一
8、例外地将导致对应于 mRNA 5 端序列出现缺失和重排 ,因而该方法目前很少使用。,2. 置换合成法该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性 ,而是在 dNTP 存在下 ,利用 RNA 酶 H 在杂交链的 mRNA 链上造成切口和缺口。从而产生一系列 RNA 引物 ,使之成为合成第二链的引物 ,在大肠杆菌 DNA 聚合酶的作用下合成第二链。该反应有3 个主要优点 : (1) 非常有效 ; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化 ;(3) 不必使用S1 核酸酶来切割双链cDNA 中的单链发夹环。目前合成cDNA 常采用该方法。四.cDNA 的分子克隆
9、已经制备好的双链cDNA 和一般 DNA 一样 ,可以插入到质粒或噬菌体中,为此 ,首先必需连接上接头 (Linker), 接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链 cDNA 的末端接上一段寡聚dG 和 dC 或 dT 和 dA 尾巴 ,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。合成的cDNA 也可以经 PCR 扩增后再克隆入适当载体。第二节 . 动植物组织mRNA 的提取一、材料水稻叶片或小鼠肝组织。二、设备研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。三、试剂1、无 RNA 酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（ 180 2 小时
10、）装蒸馏水，然后加入0.01%的 DEPC （体积 /体积），处理过夜后高压灭菌。2、 75%乙醇：用DEPC 处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。3 、 1层 析 柱 加 样 缓 冲 液 ； 20mmol/LTrisCl(pH7.6)， 0.5mol/LNaCl ， 1mmol/LEDTA(pH8.0)， 0.1% SDS。4、洗脱缓冲液：10mmol/L TrisCl (pH7.6)， 1mmol/L EDTA (pH8.0)， 0.05% SDS。四、操作步骤（一）动植物总RNA 提取 -Trizol 法Trizol 法适用于人类、动
11、物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用 Trizol 法提取的总RNA 绝无蛋白和DNA 污染。RNA 可直接用于Northern 斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+ 分离，体外翻译，RNase 封阻分析和分子克隆。1、将组织在液N 中磨成粉末后， 再以 50-100mg 组织加入1ml Trizol 液研磨， 注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的 10%。2、研磨液室温放置5 分钟，然后以每1mlTrizol 液加入 0.2ml 的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒。3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加 0.5ml 异丙醇
12、的比例加入异丙醇，室温放置10 分钟， 12000g 离心 10 分钟。4、弃去上清液，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4下 7500g 离心 5 分钟。5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10 分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA 的溶解度。然后将RNA 溶于水中，必要时可55 -60水溶10 分钟。 RNA 可进行mRNA 分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70。 注意 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。2、加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上，RNA 沉淀在 70%乙醇中可在4保存一周， -20保存一年。（二）
13、 mRNA 提取由于 mRNA 末端含有多poly(A)+ ，当总RNA 流径 oligo(dT) 纤维素时，在高盐缓冲液作用下， mRNA 被特异的吸附在oligo(dT) 纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA 可被洗下，经过两次oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯的mRNA 。1、用 0.1mol/L NaOH悬浮 0.5-1.0g oligo(dT) 纤维素。2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC 处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml ，用 3 倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。3、用 1x 柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH
14、值小于 8.0。4、将（一）中提取的RNA 液于 65温育 5 分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x 柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA 溶液进入柱床后，加入1 倍柱床体积的1x 层析柱加样溶液。5、测定每一管的OD260 ，当洗出液中OD 为 0 时，加入2-3 倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3 至 1/2 柱床体积分管收集洗脱液。6、测定 OD260 ，合并含有RNA 的洗脱组分。7、加入 1/10 体积的 3M NaAc(pH5.2) ， 2.5 倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20 30 分钟。8、4下 12000g 离心 15 分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇
15、洗涤沉淀，4下 12000g离心 5 分钟。9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10 分钟，或真空干燥10 分钟。10、用少量水溶解RNA 液，即可用于cDNA 合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70）。注意 1 、 mRNA 在 70%乙醇中 -70可保存一年以上。2、 oligo(dT) 纤维素柱用后可用0.3mol/lNaOH 洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（ NaN3 ）冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH 水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。第三节植物病毒RNA 提取大多植物病毒RNA 为单链 RNA ，并且其极性与mRNA 极性相同， 植物病毒RNA 提取较
16、为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。一、材料提纯 TMV 病毒液（ 10mg/ml ）。二、设备冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。三、试剂TE- 饱和酚 :氯仿（ 1:1），氯仿， 3M NaAc(pH5.2) ，乙醇 (100% 和 70%)， TE 缓冲液，无 RNA 酶的双菌水。四、操作步骤1、取一 eppendorf 管加入提纯 TMV （ 10mg/ml ）400ml，再加入等体积酚 /氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡 1 分钟， 4下 12000g 离心 10 分钟。2、吸取水相于一新eppendorf 管，再用酚 /氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。3、吸
17、取水相于新 eppendorf 心管，加入等体积氯仿， 用手倒置离心管数十秒， 4下 12000g 离心 10 分钟。4、取水相，加入 1/10 倍体积的 3mol/L NaAc(pH5.2) ，2.5 倍体积的冰冷乙醇， 混匀，-20 30 分钟。5、4下 12000g 离心 15 分钟，小心弃去上清液，用 70%乙醇洗涤沉淀， 4下 12000g 离心 5 分钟。6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥菌水或 TE 缓冲液中。7、取 10ml 进行电泳分析，另10ml5 分钟或空气干燥用于 cDNA 合成。10 分钟，并溶于无RNA酶的双注意 1 、整个操作应尽可能在低温下进行。2、由于病毒RNA
18、镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。第四节cDNA 合成技术一、 Riboclone M-MLV(H- ) cDNA合成技术Promega公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNaseH 缺失突变株取代AMV反转录酶 ,使合成的 cDNA 更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶 ,cDNA 第二链合成采用置换合成法,采用 RNaseH 和 DNA 聚合酶进行置换合成最后用 T4 DNA 聚合酶切去单链末端,方法简便易行。该系统试剂包括：,20g 特异性引物200l M -MLV第一链缓冲液
19、(5 )，配方如下: 250mmol/LTris ClpH8.3(37 时 );375mmol/l KCl; 15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物(各 2.5mmol/L)2625rRNasinR RNA酶抑制剂10,000 M-MLV反转录酶, RNase H-5g 对照RNA400l M-MLV 第二链缓冲液(10 )，配方如下：400mmol/L Tris Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl;44mmol/L MgCl2; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。500
20、 RNase H500 DNA 聚合酶100 T4 DNA 聚合酶21.25ml 不含核酸酶的水以上所有试剂除对照RNA需在 -70保存外 ,其余均可保存于-20 ,可以合成40gmRNA 。（一）第一链合成1. 试剂 -32 P dCTP (400Ci/mmol) ，EDTA (50mM 和 200mM) ，TE- 饱和酚 :氯仿（ 1:1），7.5M NH4Ac ，乙醇 (100% 和 70%)，TE 缓冲液。2. 操作步骤(1) 取一灭菌的无 RNA 酶的 eppendorf 管 ,加入 RNA 模板和适当引物 ,每 g RNA 使用0.5 g引物 (如使用 Not引物接头 ,使用 0.
21、3 g),用却至室温 ,离心使溶液集中在管底,再依次加入5第一链缓冲液5lrRNasin RNA 酶抑制剂25UH2 O调整体积至15 l, 70处理5 分钟 ,冷M-MLV(H- )反转录酶200UH2 O调至总体积25l(2) 用手指轻弹管壁,吸取5l至另一eppendorf管，加入2-5Ci -32 P dCTP(400Ci/mmol), 用以第一链同位素掺入放射性活性测定。(3) 37 (随机引物 ) 或 42 (其它引物 )温浴 1 小时(4) 取出置于冰上(5) 掺入测定的 eppendorf 管加入 95l 50mM EDTA 终止反应 ,并使总体积为 100l。可取 90l进行
22、电泳分析 (先用苯酚抽提 ),另 10l进行同位素掺入放射性活性测定。第一链合成eppendorf 管可直接用于第二链合成注：以上 25l反应总体积中所用RNA 量为 1g,如合成 5g RNA, 则可按比例扩大反应体积 , 倒 5g RNA 使用 125l总体积进行合成。（二）第二链合成1、 取第一链反应液20l, 再依次加入10第二链缓冲液20lDNA 聚合酶 23 RNase H 0.8 H2O 加至终体积为100l2、轻轻混匀 ,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定管,加入 2-5Ci -32 P dCTP。,可取出10l至另一eppendorf3、 14温浴 2 小时 (如需合成长
23、于3kb 的 cDNA,则需延长至3-4 小时 )。4、 掺入测定eppendorf 管中加入90l 50mM EDTA,取 10l进行同位素掺入放射性测定,余下的可进行电泳分析。5、 cDNA 第二链合成离心管反应液70处理 10 分钟 , 低速离心后置冰上。6、 加入 2 T4 DNA 聚合酶 , 37温浴 10 分钟。7、加入 10l 200mmol/L EDTA 终止反应。8、用等体积酚:氯仿抽提cDNA 反应液 ,离心 2 分钟。9、水相移至另一 eppendorf 管 ,加入 0.5 倍体积的 7.5M 醋酸铵 (或 0.1 倍体积的 1.5M 醋酸钠 ,pH5.2), 混匀后再加
24、入 2.5 倍体积的冰冷乙醇 (-20 ), -20 放置 30 分钟后离心 5 分钟。10、 小心丢去上清液,加入 0.5ml 冰冷的 70%乙醇 ,离心 2 分钟。11、 小心移去上清液,干燥沉淀。12、 沉淀溶于10-20l TE缓冲液。（三）同位素掺入放射性活性测定、计算和电泳分析1. 试剂1mg/ml 鲑鱼精 DNA ， 三氯乙酸 (TCA, 5% 和 7%)，碱性琼脂糖胶，碱性胶电泳缓冲液，（ 30mM NaOH ，1mM EDTA ），2样品缓冲液，（ 20mM NaOH ，20% 甘油，0.025%溴酚蓝）。2. 操作步骤(1) 各取一 2(5)中和二 (4)反应液各 3l,点
25、于玻璃纤维滤纸 ,室温干燥 , 这些样品代表总放射性活性。(2) 同样各取 3l 中反应液至含有 100l(1mg/ml)鲑鱼精 DNA 中 ,混匀 ,加入 0.5ml 5%TCA,涡旋混合仪混合后置冰上5-30 分钟。(3) 用玻璃纤维滤纸过滤,用冰冷的5% TCA 洗三次醇漂洗 , 这些样品代表掺入放射性活性。(4) 分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度,每次用 5ml TCA, 再用 5ml 丙酮或乙,可用盖革计算器,也可用液闪计数。3. 第一链产量测定第一链掺入率(%)= 掺入 cpm/总 cpm 100%掺入 dNTP(nmol)=2nmol dNTP/ l反应体积 ( l)
26、 (一链掺入率第)设 330 为每 mol dNTP 的平均分子量合成 cDNA 量 (ng)=掺入 dNTP (nmol) 330ng/nmolmRNA 向 cDNA 转变率 =合成 cDNA 量 (ng) / 模板 RNA 量 (ng) 100%例如总放射性活性强度为254,000cpm, 掺入放射性活性强度为板量为 1g,反应体积为25l, 则 :掺入率 3040/254000100%=1.2掺入 dNTP 量 =2nmol dNTP / l 251.2%=0.6nmol合成 cDNA 量 =0.6nmol dNTP330ng/nmol=198ng3040cpm,所用RNA摸一链mRNA
27、 向 cDNA 转变率 =198nm/1000ng 100%=19.8%由于 1000ng RNA 中 20%(5l/25 用l)于掺入测定,而反应体积占总体积cDNA 合成量为0.8 198ng=158ng。80%,因而实际第4. 第二链产量计算除需去除第一链掺入dNTP 外 ,方法同第一链产量计算第二链掺入率= 掺入放射性活性/ 总放射性活性 ?掺入 dNTP 量 (nnol)=0.4nmol dNTP/l反应体积 ( l)第一链掺入nmol 第二链掺入率第二链 cDNA 合成量 (ng)=nmol dNTP 330ng/nmol双链 cDNA 转变率 =双链 cDNA 合成量 (ng)/
28、 单链 cDNA 合成量 (ng)例 : 第二链掺入放射性活性强度为2780cmp, 总放射性活性强度为235000cpm.第二链掺入率=2780/235000100%=1.18%第二链合成dNTP 量 =(0.4nmol/l 1000l).48nm 1.18% =0.47nmol合成第二链cDNA 量 (ng)=0.47nmol 330ng/nmol =155ng双链 cDNA 转变率 =155ng /158ng 100%=98%一般 cDNA 第一链转变率和双链转变率以12-50%和 50-200% 为好。（四）电泳分析通常合成的cDNA 第一链和第二链长度为350-6000 碱基 ,需进
29、行 1.4%碱性琼脂糖电泳。将第一链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提 ,乙醇沉淀，方法见本章（二）第二链合成中的 9-12 步，一般第一链和第二链上样量相同。1. 标准分子量 DNA 参照物的同位素标记(1)通常使用 DNA/Hind片段 ,用 Klenow DNA聚合酶进行 32 P 标记10Hind 缓冲液 2.5 ldATP 0.2mmol/LdGTP 0.2mmol/L -32 PdCTP(400Ci/mmol) 2 CiDNA/Hind标准 DNA 1gKlenow DNA 聚合酶 1加 H2O到总体积 25l(2)室温放置10 分钟 , 加 2.5 l 200mM EDTA终
30、止反应 , 加入 2样品缓冲液 ,贮存于-20。2. 电泳分析(1) 用 50mM NaCl, 1mM EDTA制备 1.4% 的碱性琼脂糖电泳, 并置碱性电泳缓冲液中30分钟。(2) 取样品液 , 用 TE 调整体积 , 使第一链和第二链产率测定液的体积相同,加入等体积的 2样品缓冲液 (20mmol/L NaOH, 20% 甘油， 0.025% 溴粉兰 )。(3)加样 ,电泳到染料距前沿线只剩胶长度的1/3 处，电泳缓冲液为30mmol/L NaOH,1mmol/L EDTA 。(4)将胶浸入 7% TCA 中,室温放置 30 分钟 (直至染料由蓝色变至黄色),取出置滤纸上 ,干燥数小时。(5)用保鲜膜包裹干燥的胶 ,室温压 X 光片 (用增感屏时 -70压片 )。