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1、新型酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂的合成、生物活性及分子动态模拟研究目的 : 蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2是新的抗肿瘤药物研究靶点。 为寻找新的具有较强抗肿瘤活性的SHP2抑制剂 , 本课题以文献报道的SHP2抑制剂 GS493,SHP836等为先导化合物 , 设计、合成了苯磺酸和吡嗪胺两类新的衍生物; 测试了苯磺酸类衍生物对SHP2蛋白活性中心的抑制作用 ; 在细胞水平测试了所有化合物对人乳腺癌细胞MDA-MB-231和非小细胞肺癌NCI-H1975的增殖抑制活性 ; 选择活性较好的化合物 If 、IIe 进行计算机辅助的分子动力学研究 , 以探讨它们与 SHP2作用的具体模式及对SHP2的选择性。
2、方法 :1. 目标化合物的设计与合成: （1）保留 GS493的苯基腙吡唑啉酮以及磺酸基团 , 用内脂环或酰胺代替1 位苯环的硝基 ,3 位苯环的硝基替换为氟、甲氧基等基团, 设计了 12 个目标化合物Ia-Il 。其合成方法为 : 对硝基苯甲酸经酰氯化, 再与胺反应形成酰胺 , 然后再将其硝基还原 , 重氮化 , 还原 , 得到 N-取代 -4- 肼基苯甲酰胺中间体 ; 对氨基苯磺酸经过重氮化 , 与取代苯甲酰乙酸乙酯耦合得到 4-2-1- 乙氧基 -3- （4- 取代） -1,3- 二氧代丙 -2- 基 肼基 苯磺酸中间体 , 其再与 N-取代 -4- 肼基苯甲酰胺中间体反应得到目标产物
3、Ia-Il 。（2）保留SHP836,SHP099的吡嗪胺结构 ,3 位引入新的芳环或芳杂环替代二氯苯环 ,6 位引入大位阻的取代哌嗪基团, 设计了 12 个目标化合物IIa-IIl。其合成方法为 : 以 2- 氨基 -3- 溴-6-氯吡嗪为起始原料 , 与取代硼酸发生Suzuki 反应 , 得到 2- 氨基 -3- 取代-6- 氯吡嗪中间体 , 其再与取代哌嗪发生亲核取代反应, 得到目标产物 IIa-IIl。2. 目标化合物的生物活性评价:（ 1）使用 SHP2试剂盒检测了化合物 Ia-Il对 SHP2蛋白的抑制活性 ; （2）采用 MTT法检测了所有目标化合物对人乳腺癌细胞 MDA-MB-
4、231和非小细胞肺癌 NCI-H1975细胞的增殖抑制活性 ; （3）活性较好的化合物 IIe 作用于细胞NCI-H1975 48 h 后, 采用流式细胞术检测化合物对细胞凋亡影响。3.分子对接与动态模拟 : （1）使用分子对接与动态模拟软件探讨目标化合物与蛋白的结合模式及强弱。 （2）使用 Autodock Vina 软件将所合成的所有目标化合物与 SHP2及其同源蛋白 PTP1B,TCPTP,SHP1进行分子对接 , 结合分子动态模拟评价其选择性。 结果 :1. 本课题设计、 合成了 12 个 4- （2- 取代肼基）苯磺酸衍生物以和 12 个 3,6- 二取代吡嗪 -2- 胺衍生物 ,
5、所有目标化合物通过 1H-NMR、13C-NMR、IR 和 MS进行了结构确证。 2.SHP2蛋白活性抑制实验表明 , 化合物 If 的活性较好(IC50=0.23 0.07 M), 强于PHPS1(IC50=2.730.43 M), 但是弱于GS493(IC50=0.180.02 M);MTT法检测化合物抑制肿瘤细胞增殖活性实验表明, 在细胞 NCI-H1975上, 化合物If(IC50=3.38 1.85 M)的活性优于 GS493(IC50=20.921.23 M)。化合物 IIe 、IIi、IIk 能够显著抑制非小细胞肺癌细胞NCI-H1975细胞的增殖 , 其中化合物 IIe 、II
6、i的 IC50分别为 11.84 0.83 M、10.30 0.69 M,活性优于化合物 GS493(IC50=19.081.01 M)。流式细胞仪检测结果表明 , 化合物 IIe 对细胞 NCI-H1975存在促进其凋亡的作用 ; 在细胞 MDA-MB-231上, 化合物 If 在作用细胞 72 h 时, 其 IC50值为 28.94 6.23 M,活性强于PHPS1(IC50=30.026.59 M), 略弱于GS493(IC50=26.311.59 M)。化合物 IIe 、IIi、IIk 作用效果均优于GS493(IC50=25.021.47 M), 其中化合物 IIe 的活性最好 ,
7、其 IC50 值为 5.66 2.39 M。3. 分子对接和动态模拟结果表明 , 化合物 If 能与 SHP2 蛋白的 PTP活性中心形成的多个氢键。 IIe 作用于 SHP2 非活性中心 , 可能是与变构位点结合。其萘环以及二氯苯基可与 SHP2 蛋白变构位点孔径更紧密崁合。与 SHP2其它同源蛋白对接结果表明 ,IIe 对 SHP2显示了较好的选择性。结论及创新点 : 本课题以文献报道的 SHP2抑制剂 GS493和变构酶抑制 SHP836,SHP099为先导化合物 , 设计并合成了 24 个新的化合物 , 在蛋白水平测试了部分化合物其对 SHP2的抑制作用 , 在细胞水平测试了所有化合物其对SHP2激活突变的人乳腺癌细胞MDA-MB-231和非小细胞肺癌NCI-H1975的增殖抑制活性。结果发现4-（2- 取代肼基）苯磺酸衍生物（If ）和 3,6- 二取代吡嗪 -2- 胺衍生物（IIe ）展现了较好的抗肿瘤活性。 计算机辅助的分子对接及动态模拟研究表明 ,If 作用与 SHP2的催化活性中心 , 而 IIe作用于 SHP2非活性中心 , 可能是与变构位点结合。化合物IIe 对 SHP2蛋白显示了一定的选择性。相比于作用于SHP2催化活性中心的抑制剂 , 变构酶抑制剂效果更好。