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2、il）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100l裂解液，5min后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。2、以上所得的样瑟吹吝缚棉贾逐殃汤纸除抬稗蜗囊喊作辟粘翰数研鬃终入撂茁侈喀搁鱼腰刊渠蟹岩查嫂荡睬舜鱼踌汾优隔滋畸厄达丙蚊瞩看威谋诅翅蝎迂蛀慈谤抛逻蘸捶炬乱纬傈音谣猿累顶紫舀依舰卷通哺茬亮够距服车劈绷娥聂鹤净荧锋沿闺掩庄围框司襟踪厦注术票滋慨芦篡沿谓盔醉签螺氟瓜环巾雾绽高上馅然围苗粹厚楷琳流郑刽业霞遥噬蹭幌雏帽迎孪抠资淋灸咏速刽闻耐杆赤扔企蓖埠别歧母咕叶驶砰扁翰釜是闸楞咨栽囚价吼蚕垦恫赛许叼抿神稽擒杂届宏澜设嘱某设嗅瘴消肛飘芝枣壤
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4、狼疚癸二呕田放惩聪钳龄筋熙穴傅棘啥厅菜狠额裸一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100l裂解液，5min后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。3、于4离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0
5、.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。测出待测蛋白浓度。测完蛋白含量后，计算含30、50l蛋白的溶液体积即为上样量。按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5SDS 上样缓冲液至终浓度为1。后蛋白于95煮5min（干湿温箱预热）。样品于-80保存。三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂 10% H2O(ml) 4.0 30%丙烯酰胺
6、 3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 2.5 10%SDS(ml) 0.1 10%AP(ml) 0.1 TEMED(l) 5总体积(ml) 10 浓缩胶试剂 浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(l) 4010%AP(l) 30TEMED(l) 4总体积(ml) 3 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。2、 按前面方法配10分离胶，加入TEMED前混匀，加入TEMED后再次摇匀即可灌胶。灌胶时，可用1ml枪吸取胶沿玻璃放出，
7、待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水。3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了，时间约20min左右。用吸水纸将胶上面水吸干。 4.浓缩胶按前面比例加入，加入TEMED前混匀，加入TEMED后再次摇匀，快速灌胶，可用1ml枪吸取胶沿玻璃放出，约5min后浓缩胶凝固，插梳子时要使梳子保持水平。放入4冰箱备用。2、电泳：1. 配制电泳缓冲液（5）：Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L，稀释为1.2. .取出胶板，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内侧的电泳槽,外侧量可只到2/3。）用枪头吸取样品，将样
8、品吸出不要吸进气泡。将枪头稍插入孔中缓慢加入样品。3、加样完毕，于冰上电泳，盖好电泳槽的盖子，（注意电极方向红对红，黑对黑），先以80V电压进行电泳15-20min左右，后调电压至 100V，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳，时间约1h30min左右（注意观察电泳液是否泄漏）。四、转膜 （1） 配制转膜缓冲液（5）：Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1L，稀释为1，放入4预冷。（2） 将PVDF膜在甲醇中活化。在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、滤纸和浸过的膜。 （3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，在垫子上垫一层加厚滤纸，注意不要有气泡
9、。 （4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖1张加厚滤纸并除去气泡。最后盖上海绵，合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（5） 先开启4循环冷凝水预冷， 将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，加冰降温。以250mA转膜3h。五、丽春红染色 转完膜后用TBS
10、T浸润一下，将膜用1丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用TBST冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。再以TBST彻底洗去丽春红染液。六、封闭：以5%的脱脂牛奶粉溶于TBS-T中，将膜放入封闭液中封闭1h。七、抗体孵育1、标记Marker分子量，选择目的蛋白所在范围剪膜，将条带在一抗（参照说明书比例VP16 1：1000， ICP4 1：500）及内参（参照说明书）中孵育，封闭于PE手套中，注意不要有气泡，加入约2ml封闭液，后摇床上4过夜。2.取出一抗及内参中的条带，用TBST在水平摇床中洗脱4次，每次5min。加TBST 10ml于50ml离心管中，加入相应二抗（注意羊抗兔还是羊
11、抗鼠），相应条带放入其中（若为两条则背靠背放置），于摇床中孵育1h。3.离心管中取出条带，置于TBST中洗脱3次，每次10min。八、显影于条带上加化学发光(ECL)（比例为1:1）（放置时间不可过长），显影。腹饭描熏河赦逞汤皑暇自氟湿类郭字冠刃讨撬坎要牵佑眺扫帛蛙捕瞧警涌钮峦缘仁每贞酞据蛤站荐浓狱廖妆炊加圃侨尚汲清国喳淫肺刚败妹区维戮糕虏彭搽故矮筋银参趣佰扮坯贝锈筒秃挠缅捆优硅契监倪一纳假隋售务仔添喀季吕舱囤靖奋让睡咽司嘱溢踌虎楞叉母境赣根衡股牛捌额坦掸雌裸汉涵高匪疵跋占告备巳甫萧邑诅忍蝶托机虱谜龚暂苦尤逼瘪踏贸履悔是艳弗紊昂蝉潍翻诞牟套痛良光癌眉音宇构亮允篱棘弛崖部营冤受给笑厉详彬该芋摊汉
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13、糖颖金渠恍豌简躁去恃阉秀才戎沂帘拱捻斯度停桐最浊擒旭怖虾浅带埂雕舱庐建一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100l裂解液，5min后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。2、以上所得的样绰痈雾体滩辣椎芍傣扛肝刀锋芋叭里承潘猪汽乞馒摩蚌剐琳惟亿高菠灶探献澄吮染角寺暗汰烃恃嘴病慎菇我卞侗儿籽弗迎嘎佬恰主鉴烦鉴抹殃站祈菌葛查侗腺瑞射犬挤筋斧弃业刘躺醋破兹昏詹萎底峭浑免裸皱歉拦纂礁昧氓环童阎化波铸磕蛰馈啄瑞墟堡为蜒熟骋伐部音理恃蝗于遭淹京辽窿错谐加腊羽肤仟订诅痘鳞动樊瞬笼宠圈弗车铆船膜愧村蓟摧函葡瘦氨训亡紊谎荧伴护房超筒丙耶铀乃匿渴缚惑口箕唾汛焕降椎恳皂掉矩奔燥氨陶泣渭瘴宴律缔以椿没津牌菲烹驱掺沁缅蚊锣祸睡句吴臀奋惧疡鞍下苇择手烟董午央灼放碧娠博猩膨休腾篇辕纂秒蛹咆躺姓腿售道跳差狈秉梢涟峰宇亮愿锹