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1、基因组学技术在致病基因发现,1,基因组学技术在致病基因发现 及临床诊断中的应用,基因组学技术在致病基因发现,引言,对疾病的研究一直是人类科研活动的重点和热点之一 人类所有疾病都具有遗传影响和背景，但只有在一少部分疾病中，遗传因素起主要作用 遗传病通常具有先天性、终生性和家族性的特点,2,基因组学技术在致病基因发现,遗传病分类 单基因遗传病研究策略回顾 复杂疾病研究策略回顾 应用二代测序技术寻找易感基因,3,基因组学技术在致病基因发现,遗传病分类,单基因遗传病 多基因遗传病 染色体疾病 线粒体疾病 体细胞遗传病,4,基因组学技术在致病基因发现,权威的在线人类孟德尔遗传数据库（Online Men
2、delian Inheritance in Man，OMIM），目前已收录的以孟德尔遗传方式为主的遗传病约6700种，其中常染色体连锁的约6200中，性染色体连锁的500种。在这6700多种遗传疾病中，其中已确定其分子遗传基础的单基因病接近3000种，表型已知而致病分子基础未知的约有1830多种。由于单基因病的遗传异质性，还有很多的亚型未被发现。,基因组学技术在致病基因发现,单基因遗传病,OMIM Statistics for May 3, 2011,6,基因组学技术在致病基因发现,多基因遗传病,遗传方式复杂，无显性和隐性之分，故也称多因子遗传或复杂疾病。常见的有唇腭裂、先天性下颌前突、高血压
3、、糖尿病、精神分裂症、类风湿性关节炎及先天性心脏病等。 复杂疾病的发病率常有地区或族群差异。比如在世界范围内，唇腭裂的发生率约为1/700，拉美、亚洲发生率高，非洲较低。下颌前突亚洲群体发病率较高，大约有8%40%，非洲为3%8%, 欧美较低，约为0.4%4%。,7,基因组学技术在致病基因发现,染色体疾病,数目性染色体畸变 例子如Down综合征，即21三体综合征表型特征有智力低下、伸舌、鼻梁低平、眼裂上斜、小耳、小颌、枕平、内眦敖皮、颈短及肌张力减低等，常伴有先天性心脏发育缺陷 结构性染色体畸变 是在细胞分裂过程中曾有染色体断裂所致。常见的结构异常有缺失、环状染色体、易位、重复、倒位和等臂染色
4、体。如毛细血管扩张性共济失调症 染色体数目异常比结构异常更常见,8,基因组学技术在致病基因发现,疾病致病基因查找研究,疾病致病基因查找 对疾病的诊断与治疗有巨大意义 除DNA水平，还有RNA、蛋白、细胞水平等 自动化DNA测序仪与微阵列芯片-强有力工具 人类基因组计划完成 总体框架 传统的基于连锁不平衡（LD）的方法 基于家系的Linkage分析 基于大样本的Association分析 很多成功范例,基因组学技术在致病基因发现,疾病致病基因定位研究,罕见疾病 感染率低（1/1000），样本少 患者生存期短，难以繁衍后代，家系不完整 基于LD的方法的不足 罕见疾病-无完整家系, 无大样本 定位粗
5、糙，无法确定真正的基因或位点，靠DNA测序 直接测序 精确测定个体基因组序列，可发现细微差别 通过比较多个同疾病类型个体的突变数据，寻找共同突变基因 Sanger测序技术成本高，方法复杂,基因组学技术在致病基因发现,单基因病研究策略简要回顾,功能克隆 绝大多数遗传病的致病机制是不为人知的，因此致病基因的产物是不清楚的，也就无法运用功能克隆策略。 位置克隆 其最大优点是不需要事先对致病基因相关功能的了解。利用连锁分析或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体的某一特定区域。 位置候选克隆 针对基因组上已定位的候选区域，对其中已注释的基因、表达序列标签、开放阅读框、cDNA片段等数据信息进行整合分析，
6、按照功能信息来预测和筛选的致病基因。在此基础上，设计实验鉴定和验证致病基因。,11,基因组学技术在致病基因发现,单基因病研究策略简要回顾,参数连锁分析方法 需要提供各项描述疾病遗传模式的参数，主要包括致病基因频率、各基因型的外显率。一般指LOD Score法 非参数连锁分析方法 由于很多遗传病的基因频率未知，同一种疾病在不同家系的遗传模式和外显率也有变化。非参数分析避开对遗传模式的猜测。,12,基因组学技术在致病基因发现,多基因病研究策略简要回顾,关联分析 HapMap计划的实施和SNP芯片技术的成熟使得大样本量的关联解析在近10年间迅速流行。加之收集散发样本较收集大家系样本容易，使得关联分析
7、的更受推崇。 连锁分析 由于很多复杂疾病通常未表现出明显的孟德尔遗传模式，导致参数连锁分析在其易感定位研究中的应用受到限制。尽管如此，利用家系定位复杂疾病易感基因也不乏成功的例子。如乳腺癌易感基因BRCA1, 2的确证。 另外，结合初步连锁分析和后续关联分析的方法已经成功定位了几个复杂疾病的易感基因，如2型糖尿病的NIDDM基因及哮喘病的ADAM33基因,13,基因组学技术在致病基因发现,家系样本收集,14,独生子现象，导致难以收集大家系 相关资料收集齐全，尽量多收样本 长期收集，保持回访,基因组学技术在致病基因发现,家族性高胆固醇血症,15,基因组学技术在致病基因发现,家族性高胆固醇血症,1
8、6,先证者父母胆固醇都较高,基因组学技术在致病基因发现,17,基因组学技术在致病基因发现,SNP芯片全基因组连锁分析,SNP标记最大的特点在于单个SNP位点只有两个等位基因，杂合度低，多态性不够，但是可以通过分析相连SNP位点构成的单体型来增加信息量。 利用SNP芯片进行连锁分析，并精确定位到连锁区域或易感基因的研究有很多。甚至在有些研究中，采用高密度的SNP连锁分析发现了被STR连锁分析漏掉的显著连锁信号。 基于SNP的连锁分析较传统的基于STR的连锁分析更为高效、便捷，且其检测连锁信号的效力可能更强。,18,基因组学技术在致病基因发现,Illumina Infinium Human Lin
9、kage-12 panel,平均间距 0.55 cM 441 kb,19,基因组学技术在致病基因发现,Illumina HumanCNV-370 芯片,370,000 loci 318,000 tag SNPs,20,基因组学技术在致病基因发现,数据分析方法,Genome Studio Call rate 99% CNV partition 至少连续5个探针,21,基因组学技术在致病基因发现,数据分析方法,连锁分析 Merlin Genehunter Mendel 单体型分析 Merlin Haplopainter CNV partition,22,基因组学技术在致病基因发现,连锁分析流程,2
10、3,基因组学技术在致病基因发现,参数连锁分析在复杂疾病中的应用,在复杂疾病连锁分析中，很多研究倾向于非参数分析，避开对遗传模式的猜测 仍有一些学者认为参数连锁在复杂疾病研究中仍然有不可替代的优势 在很多研究采用一系列不同的遗传模式，以得到最优遗传模式参数 最好结合参数和非参数分析的结果，二者吻合度到，共同支持的连锁区域更可信。,24,基因组学技术在致病基因发现,参数连锁分析在复杂疾病中的应用,双致病位点连锁分析在定位到两个或多个候选区域的复杂疾病家系研究中，具有重要意义 双致病位点模式可以提高复杂疾病连锁信号的检测效能。这种方法已在多项复杂疾病如家族性高胆固醇血症、静脉血栓栓塞和双相情感障碍研
11、究中成功运用。双区域连锁分析数值高于与单个区域连锁值提示遗传因素相互影响是客观存在的。而这种优势越明显，则越支持两个区域的相互作用。,25,基因组学技术在致病基因发现,CNV与疾病,CNV不仅在基因组中广泛存在，而且在基因富集区尤为突出。 大量研究已证实CNV是某些复杂疾病的易感因素，与人类的一些复杂性状，如个体之间的感官差异（包括嗅觉、听觉、味觉和视觉）也有关系。 目前已知多种复杂疾病与特定基因的CNV有着明确关系。目前，关于基因组内CNV与疾病的相关性仍处在广泛的研究中，可以肯定的是，其中高频拷贝数变异区域往往在减数分裂时产生重排，导致发育异常类疾病。,26,基因组学技术在致病基因发现,总
12、体结论,基于类似孟德尔遗传的大家系（患者大于10例，至少3代），采用SNP芯片连锁分析是定位复杂疾病易感基因的有效方法之一。 双致病位点连锁分析在定位到两个或多个候选区域的复杂疾病家系研究中，具有重要意义。,27,基因组学技术在致病基因发现,应用二代测序技术寻找易感基因,外显子组测序 单个病例、病例组、核心家系 全基因组测序 几个病例、癌组织,28,基因组学技术在致病基因发现,应用二代测序技术寻找易感基因,随着二代高通量测序技术的成熟，基于家系样本和少量病例样本的全基因组重测序和外显子组重测序在疾病易感基因研究方面开始显现巨大优势。 目前，已有数十种疾病通过外显子组重测序成功定位到了新的易感基
13、因及突变，比如恶性黑素瘤、和痉挛性截瘫。全基因组重测序主要是在癌症这样异常复杂的疾病研究中应该更广泛，比在肝癌和乳腺癌。,29,基因组学技术在致病基因发现,外显子捕获测序（WES）技术,外显子区域 基因组主要功能区 至少85%孟德尔遗传疾病突变位点位于外显子域 只占全基因组1%区域，数据量小 外显子捕获测序 多重探针杂交，特异扩增 2009 年首次应用于致病基因的筛选 Freeman Sheldon syndrome， 4样本-MYH3，验证了已有研究结果。 （NG S B, Jay Shendure, Nature，2009） 2010年科学杂志十大科学突破之一,基因组学技术在致病基因发现,
14、WES筛选疾病致病基因策略,筛选目标 引起氨基酸变化的未知或已知罕见突变（missense, nonsense, splice SNP, coding Indel） 筛选方案,基因组学技术在致病基因发现,WES实验方法,外显子捕获试剂盒及实验 Agilent 公司SureSelect Human All Exon Kit试剂盒（有效覆盖区域 30M） Pair-end文库 Illumina Paired-End Genomic DNA Sample Prep Kit (p/n PE-102-1001)试剂盒，平均插入片段长度200 测序平台及实验 Illumina Hiseq 2000 单样本
15、单道（lane），目标测序长度100，循环次数为108次,基因组学技术在致病基因发现,WES数据分析,目标：Rare或novel突变，NS/SS/cIndel 流程图,基因组学技术在致病基因发现,WES数据分析,方法和软件 选择依据：1000 Genomes使用软件 使用软件 原始数据质量评估与过滤 - SolexaQA软件包 原始数据定位（Reads Alignment）软件- BWA软件 数据校准和重定位 Genome Analysis Toolkit（GATK） 突变和插入缺失查找 Samtools dbSNP 和1000 Genomes 位点过滤 - 自编Perl 程序 基因注释 自编
16、程序 突变功能评估 - Polyphen-2,基因组学技术在致病基因发现,突变基因筛选,复合杂合突变基因 - 筛选流程,基因组学技术在致病基因发现,NGS突变查找中的FN和FP问题,NGS突变查找中的存在假阴性和假阳性 未知突变中的FP问题尤难发现解决 方法应用及检验：新算法，后续大样品SNP验证,基因组学技术在致病基因发现,NGS突变查找中的FN和FP问题,FN主要与测序覆盖度有关 FP主要来自系统偏差和数据处理偏差 系统偏差： 454单碱基重复引起插入缺失；Solexa/SOLiD累计误差 数据分析偏差： 对齐错误，Paralog 突变查找软件通常计算整体的FNR和FPR,基因组学技术在致
17、病基因发现,未知突变中的FP问题,发现现象 FP在未知突变数据集(NDB)中富集，而已知位点(DB)突变数据中少。 估测 随机抽取50个候选未知突变，使用Samtools工具观察其序列对齐情况。,基因组学技术在致病基因发现,未知突变中的FP问题,碱基置换率考察 同类型碱基置换（transition）应高于不同类型碱基置换（transversion）。 结果：DB突变符合正常情况，NDB突变明显偏离。,基因组学技术在致病基因发现,未知突变中的FP问题,解释 1）已发现报导的突变位点数量巨大（24M），个体细胞中可发现的新的突变越来越少。真正突变中大部分是频率较高的已知突变。 2）相对于全基因组，
18、已报告位点只占少数（8%），随机假阳性事件大部分发生在非已报导位点。 Venter研究 Venter团队2008年基于Sanger测序数据的研究（HuRef）表明，相对于db129，至少25%的新突变是假阳性。 何况是NGS？,基因组学技术在致病基因发现,FP对未知致病基因突变查找的影响,FP对基于未知致病基因突变查找的影响 加大人工负担 降低样本利用效率 引发假阴性事件 样本过多，目标区域覆盖率不足,基因组学技术在致病基因发现,未知突变中的FP问题分析,FP突变有哪些特征，哪些最严重？ Solexa：低质量碱基，读序末端，前面有单碱基重复，插入缺失定位紊乱，单向极端覆盖，等等。 很难确定硬阈
19、值：界限不清，与设备、试剂有关。,基因组学技术在致病基因发现,未知突变中的FP问题分析,突变碱基重复（VR） JPT数据,基因组学技术在致病基因发现,应用二代测序技术研究发病机理、开发临检标志物,转录组测序 miRNA组测序 甲基化组测序 免疫组测序,44,基因组学技术在致病基因发现,An example,白血病相关的三株淋巴细胞系转录组差异表达及microRNA表达调控分析,基因组学技术在致病基因发现,研究背景, 急性淋巴细胞白血病,急性淋巴细胞白血病 以未分化或分化异常的原始幼淋巴细胞在造血组织中恶性增殖为特征，由内源性或外源性致癌物诱发DNA损伤，导致原癌基因突变或过表达以及抑癌基因失活
20、，从而引起的一种恶性血液肿瘤。,白血病细胞恶性增生活跃 细胞形态异常 细胞内多出现空泡 大量退化细胞出现 粒系、红系、巨核系细胞明显受抑,5,基因组学技术在致病基因发现,研究背景,（引自Rosenbauer Frank, et al. 2007）,辐射暴露 吸烟 有毒化学物(苯并芘、苯) 化疗 唐氏综合症及其他特定类型遗传疾病 骨髓增生异常综合征及其他特定类型血液病 一型T细胞白血病病毒（HTLV-1）感染 家族病史 ,白血病病发诱因, 白血病发生,3,基因组学技术在致病基因发现,研究背景, 淋巴系白血病转录组,（引自Staratschek-Jox, et al. 2009）,6,基因组学技术
21、在致病基因发现,研究背景, 淋巴系白血病miRNA,（引自Zac Chatterton, et al. 2010）,7,CL，Cell Line；PB，Peripheral Blood；BM，Bone Marrow；ND，Not Determined,基因组学技术在致病基因发现,研究目的及意义,通过新一代测序技术对不同淋巴细胞系中基因表达丰度和功能分析，了解淋巴系白血病细胞的转录谱基本特征； 不同分化阶段的细胞间相互比较，理解分化相关基因在调节淋巴系多方向分化过程中的重要作用； 不同白血病亚型细胞间的比较，了解不同亚型的淋巴细胞白血病之间差异形成的分子基础以及各自关键的调控因素； 从基因转录和
22、转录后调控的角度分析白血病相关的淋巴细胞间基因表达谱差异形成的主要原因，并为临床诊断、治疗及药物研发提供一定的理论基础。,Cell Line 1,Cell Line 2,Cell Line 3,mRNA,miRNA,Expression Regulation,Network,Diagnosis,Differentiation,Drug design,Therapy,10,Lymphoblastic cell lines,Diverse differential periods Leukemia related,基因组学技术在致病基因发现,材料与方法, 实验取样,RS4;11 来源于32岁急性B
23、淋巴前体细胞白血病女性病患的骨髓； Jurkat 来源于14岁急性T细胞白血病男性病患的外周血； GM 来源于正常女性静脉血，经EBV转染后永生化的B淋巴细胞。,细胞系,RS4;11,Jurkat,GM,样本制备,复苏后，悬浮培养细胞系； Trizol方法提取Total RNA； Ribo-minus方法提取mRNAmRNA-seq； Flash-page切胶18-30bp的片段miRNA-seq。,12,基因组学技术在致病基因发现,材料与方法, 整合分析策略,mRNA数据,miRNA数据,差异表达分析,基因功能分类,代谢途径富集,差异表达分析,新miRNA预测,靶基因预测,数据整合分析,DE
24、G,WEGO,KEGG,DEG,RNA fold,RNAhybrid Miranda Target Scan,miRNA 功能预测,构建 调控网络,实验验证 临床应用,17,GO KEGG,IPA,基因组学技术在致病基因发现,结果与讨论, 总体差异比较1,共表达基因聚类分析,特异性表达基因功能分类,25,基因组学技术在致病基因发现,结果与讨论, 白血病细胞差异2,原癌基因表达聚类,29,基因组学技术在致病基因发现,结果与讨论, B细胞分化差异2,细胞迁移,33,GM特异表达 上调8倍以上 上调2-8倍 上调1-2倍 下调1-2倍 下调2-8倍 下调8倍以上 RS4;11特异表达 无显著差异,基
25、因组学技术在致病基因发现,结果与讨论, 白血病细胞差异3,NOD样受体信号通路,30,上调2-8倍 上调1-2倍 下调1-2倍 下调2-8倍 下调8倍以上 RS4;11特异表达 无显著差异,基因组学技术在致病基因发现,结果与讨论, 免疫表型差异2,B细胞受体信号通路,35,Jurkat特异表达 上调8倍以上 上调2-8倍 上调1-2倍 下调1-2倍 下调2-8倍 下调8倍以上 GM特异表达 无显著差异,基因组学技术在致病基因发现,结果与讨论, 小结2,两株白血病细胞具有更相似的基因表达谱，并且在Jurkat细胞中表现出更多上调基因。 几乎所有趋化因子在白血病细胞中表达都受到抑制，而CXCR4的
26、异常表达可能与其行使细胞免疫功能和细胞迁移的触发作用相关。 不同亚型的白血病细胞拥有各自的原癌基因表达谱，两株癌细胞可能参与不同的细胞凋亡途径。 PU.1、EBF、PAX5等基因在B淋巴细胞早期分化中扮演重要角色，而IRF基因家族主要在B淋巴细胞成熟后的分化过程中起作用。 细胞免疫相关蛋白及其辅助受体在Jurkat细胞中特异性表达，而体液免疫相关蛋白及其辅助受体在GM细胞中表现为显著性上调。,37,基因组学技术在致病基因发现,结果与讨论, miRNA表达,数据注释结果,miRNA表达分布,miRNA表达数量统计,39,（571）,基因组学技术在致病基因发现,结果与讨论, miRNA聚类,miR
27、NA表达聚类,40,基因组学技术在致病基因发现,结果与讨论, miRNA差异比较,miRNA显著上调比较,miRNA表达上下调分析,特异性高表达miRNA,41,基因组学技术在致病基因发现,结果与讨论, 白血病调控网络,造血系统分化与白血病发生相关基因调控网络,42,细胞增殖、凋亡与白血病发生相关基因调控网络,基因组学技术在致病基因发现,结果与讨论, 调控网络预测1,ETS1,BMI1,RAB23,RAB9b,MYB,RELB,IRF4,NFkB2,REL,FLI1,cell cycle inhibitor,cell death,signal transduction,regulation o
28、f hematopoiesis,abnormal proliferation trigger,apoptosis,FOS,MAFK,cell survival and proliferation,differentiation,membrane trafficking,differentiation,proliferation and differentiation,blood coagulation,AP1,proliferation differentiation apoptosis,白血病发生,43,基因组学技术在致病基因发现,结果与讨论, 细胞分化调控网络,B,44,基因组学技术在致病
29、基因发现,结果与讨论, 调控网络预测2,B细胞分化,Blimp-1,PAX5,PU.1,LEF1,ID2,NOTCH,NOTCH1,NOTCH2,CD19,LMO2,ERG,RUNX1,RUNX3,45,基因组学技术在致病基因发现,结果与讨论, 小结3,在三株淋巴系细胞中检测到约15%左右的已知miRNA表达，其中80%以上表现为低或极低表达，在三株细胞中均表达的miRNA有103个。 miRNA表达谱聚类结果与转录组一致，白血病细胞之间更为相似且拥有更多上调的miRNA。 造血系统分化及白血病发生的过程由多个miRNA同时调控，这些miRNA在特定时期的上、下调影响了转录表达谱的改变。,46
30、,基因组学技术在致病基因发现,总结与展望, 总结,48,基因组学技术在致病基因发现,Summary,Justin M. Longa, 2012,基因组学技术在致病基因发现,个体化医疗 核心实验室,疾病导向标志 (癌症，心脏病，) 药物基因筛检 疾病风险评估. 预防医学,医师,病人,健康人,R&D,治疗 1 2 3 4 5,(药物, 其他),CLIA认证,组织 DNA RNA, Others,生物标志 分子影像 其他检测方法,基因诊断与个体化医疗,基因组学技术在致病基因发现,Complexity,DNA,RNA,Protein,高通量系统与癌症标记,Genome,Epigenome,Transc
31、riptome,methylation,Expression genechip and microRNA array,SNP, aCGH chips & NGS,Mass spectrometry,Methylation chip,Metabolyte,Proteome Metabolomics,New Generation Sequencing,基因组学技术在致病基因发现,71,肺癌发展过程 与 癌症标记研发,Herbst RS, N Eng J Med 2008,基因组学技术在致病基因发现,肺癌发展史与个体化医疗,时间,诊断点,高危险族群,低危险族群,癌症临床指标,基因组学技术在致病基因发
32、现,73,基因与小RNA之预后标记mRNA and microRNA Prognostic Signatures,基因组学技术在致病基因发现,74,Classification by Multiple Biomarkers,Risk score =0.47NF1+0.51HGF+0.52HMMR+ 0.52IRF4+0.55ZNF264+0.55ERBB3+0.59STAT2 +0.59CPEB4+0.65RNF4+0.75DUSP6+0.92MMD+1.32DLG2-1.09ANXA5-0.84LCK-0.77FRAP1-0.58STAT1,Weighting value: coeffici
33、ent of Cox regression Summarize the minor effects of multiple genes,Chen HY, N Eng J Med 2007,基因组学技术在致病基因发现,75,Hazard ratio was adjusted by age, sex, and stage,CPE: concordance probability estimate, refer to prediction accuracy,Shedden & Beer, Nat Med, 2008,Gene signatures and clinical variables in
34、two test sets with all stage,Fewest genes,Fewest genes,基因组学技术在致病基因发现,Biogenesis of microRNA,miRNA gene,Transcription,RNA Polymerase II,Pri-miRNA,Cap,(A)n,Cropping,Drosha-DGCR8 (Microprocessor),Pre-miRNA,Exportin 5,Nucleus,Cytoplasm,Dicer,Ago2 TRBP,Strand selection,Mature miRNA In RISC,基因组学技术在致病基因发现,
35、Base-pairing with the target mRNA,Cap,(A)n,mRNA Cleavage,Near perfect mach,Cap,(A)n,3UTR,Partial match,Translational Repression mRNA decay,miRNA的功能,Post-transcriptional gene silencing Each miRNA regulates hundreds of target mRNAs 30% of protein coding genes are regulated by miRNA Control diverse pat
36、hways: development, differentiation, metabolism, proliferation, apoptosis, tumorigenesis, metastasis,基因组学技术在致病基因发现,78,miRNA预后标记预测病患存活率,(Yu SL, Cancer Cell 2008),miR-137,miR-182*,miR-372,miR-221,let-7a,基因组学技术在致病基因发现,79,Stage-subgroup Analysis,基因组学技术在致病基因发现,80,基因与miRNA之预后标记,基因组学技术在致病基因发现,81,个体化医疗:表皮生长
37、因子受体EGFR epidermal growth factor receptor定性 vs 定量,基因组学技术在致病基因发现,东西方肺癌成因的差异性,白种人,亚洲人,EGFR (10%),KRAS (30%),ERBB2 (10%),MET (10%),Unknown (Others),EML4-ALK,EGFR (30-40%),KRAS (5%),ERBB2 (10%),MET (10%),Unknown (Others),EML4-ALK,基因组学技术在致病基因发现,83,东亚的肺癌个人化医疗Personalized Therapy of Lung Cancer in East Asi
38、a,Lung Cancer,Gene Testing (Reference Lab),EGFR,KRAS,HER2,BRAF,EML4-ALK,Gefitnib Erlotinib BIBW2992,Sorafenib(?) Chemotherapy,Trastuzumab BIBW2992,Sorafenib(?),PF02341066,MET,Met inhibitor ARQ-197?,30%,10%,5%,5%,5%,510%,NTUCGM 2011,基因组学技术在致病基因发现,84,DNA质谱仪检测EGFR突变,Primers for PCR reaction to amply in
39、terested region,Probes for specific wild-type/mutation allele detection,Starting template (sample),Amplification,Final products with different mass by single nucleotide extension,Analysis by MALDI-TOF MS,基因组学技术在致病基因发现,85,85,质谱仪与直接测序的比较,40,48,42,59,Unpublished data,基因组学技术在致病基因发现,EGFR T790M的定量,Su KY,
40、unpublished data,基因组学技术在致病基因发现,87,87,二代测序验证DNA质谱仪EGFR基因检测,Unpublished data,基因组学技术在致病基因发现,88,88,T790M突变 与 无病存活率的关系,Unpublished data,基因组学技术在致病基因发现,肺癌基因拷贝数的分析,基因组学技术在致病基因发现,基因拷贝数变化 与 EGFR突变,基因组学技术在致病基因发现,17 gain/loss genes plus 6 control genes,基因拷贝数变化 与 病人存活率,EGRF 突变,EGRF 无突变,基因组学技术在致病基因发现,92,基因拷贝数变化 与
41、 标靶治疗之疗效,基因组学技术在致病基因发现,JCO Aug 1 Online,专利申请 美国专利 US1975-2011.7.4：METHOD FOR PREDICTING RESPONSE OR PROGNOSIS OF LUNG ADENOCARCINOMA WITH EGFR-ACTIVATING MUTATIONS 世界专利：申请中,基因组学技术在致病基因发现,基因检测实验室,基因组学技术在致病基因发现,退件,复查,退件,复查,流程,Final Report,Pathologist,Reference Lab,医院收集检体及上传临床资料、(病理学报告(HE stain的图片),Hos
42、pital,复查,EGFR typing,Good Quality,Bad Quality,Check DNA&RNA Quality,Lung Cancer and High-tumor cell content,H&E stain (非必要，除非医院没上传,实验室收到检体,Non-Lung Cancer or Low-tumor cell content,Confirm cell type,基因组学技术在致病基因发现,96,EGFR 基因检测,第一线筛选 Clamp 第二线验证 DNA 质谱仪 ADx-ARMS 依医师要求 直接测序,基因组学技术在致病基因发现,实验室端：分配实验流程工作、
43、确认实验程序流畅度、掌握时效性,医院端：申请帐户、使用说明及谘询、疑难解决、检体配送掌控,报告处理及资料分析：确认实验数据及资料正确性处理联机报告发送事宜,联系沟通及谘询服务,基因组学技术在致病基因发现,肺癌标靶治疗的策略,Screening,Early detection,Diagnosis staging,Inoperable,Operable,Risk genes, SNPs, others LD Spiral CT, Smart imaging, etc,New staging system :TNMC Micrometastasis,Predict Outcome and Metastasis Chemoprevention Clinical trial,Predict Chemotherapy Response (ERCC1, RRM1) Target therapy (EGFR) Clinical trial,基因组学技术在致病基因发现,Thanks for attention!,