分子标记技术优秀课件.ppt

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1、.,1,一、分子标记的概述,广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。 蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。 狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳：能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。,第一讲 分子标记技术,.,2,DNA指纹分析研究是一种重要的分子标记技术，它包括RFLP（restriction fragment length polymorphism）、RA

2、PD（randomly amplified polymorphic DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism）、SSR（simple sequence repeat）和ISSR（inter-simple sequence repeat）等这些在PCR基础上发展起来的检测DNA多态性的分子标记技术。,.,3,分子标记的优越性表现为：（1）分子信息是可遗传的，而只有在遗传上可传递的属性才能提供评估系统发育的信息；（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3）分子标记能提供共同的尺度；（4）分子数据能将从共同祖先遗传下来的同源性和由

3、于趋同进化从不同祖先演变而来的相似性区分开来表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）任何生物有机质包括动物、植物和微生物有许多共同的分子属性，因此分子数据可提供共同尺度来直接比较任何有机体任何分类层次之间相对水平的遗传变异 ；（6）分子标记技术可应用于各个生物门类，并都可用于比较和综合分析。,.,4,分子标记的选择,理想的分子标记应该符合的标准是：多态性高；共显性遗传，在二倍体生物中能区分纯合与杂合状态；在基因组中频繁出现，甚至贯穿分布于整个基因组；选择中性；容易获得；容易操作，自动化程度高；重复性好；所获得的数据能进行交流和比较。,.,5,二、蛋白质标记,在蛋白质多态性研究基础上发展起来的分

4、子标记技术称为蛋白质标记，最常用的技术是蛋白质电泳及与其配套的专一性染色，如曾经广为采用的等位酶分析，是通过同一基因位点上不同等位基因编码的同种酶的不同分子形式，使得酶谱分析具有相关的遗传学意义，酶谱的变化反应了等位基因和位点的变化。等位酶技术为植物的种群遗传学和进化研究作出了重要的贡献。但由于等位酶缺乏足够的变异，在技术上存在一定的局限性，如今已逐渐被DNA标记所取代。,.,6,三、DNA分子标记的种类,分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类。 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括： 限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length pol

5、ymorphism, 简称RFLP标记）； DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）； 原位杂交（in situ hybridization）等；,.,7,第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction ,简称PCR反应）为核心的分子标记技术，包括： 随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）； 简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism,

6、简称SSLP标记）； 扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）； 序列标签位点（Sequence tagged sites, 简称STS标记）； 序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等；,.,8,第三类是一些新型的分子标记，如： 单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）； 表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。,.,9,四、分子标记的

7、特点,（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题； （2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限； （3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。,.,10,一）限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, RFLP） 该技术由Grodzicker等于1974年创立。 由于DNA分子中限制性内切酶酶切识别序列中出现碱基的插入、缺失、置换、倒位而导致

8、酶切位点的增减所引起的基因型限制性片段长度的差异。,五、常用的分子标记,第一类分子标记 以分子杂交为核心的分子标记技术,.,11,基因组DNA用已知的限制性内切酶消化后，产生许多大小不等的DNA片段，电泳分离、Southern印迹转移到硝酸纤维膜上，用放射性标记的探针与膜上变性的酶切DNA进行杂交，放射自显影，即可显示出不同材料的多态性图谱，即显示出所分析的DNA序列间的RFLP。,基本原理,.,12,基本步骤： DNA提取用DNA限制性内切酶消化 凝胶电泳分离限制性片段 将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上 用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称 S

9、outhern杂交） 放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。,.,13,动植物生物体由不同的器官和组织构成。应选用生物体中生长旺盛的器官、组织和细胞提取DNA，如植物幼苗或新长出的叶片、动物的血等。DNA提取的效果由DNA的质量和得率来评价。选用适当的生物器官和组织是获得高质量和高得率DNA的保证。取样后应尽快在低温中保存，长时间保存应在超低温中保存。,生物体样品的选取,.,14,作为DNA提取的开始，多细胞的生物体样品首先需要经过研磨，使样品破碎。然后样品粉末再通过裂解液把细胞裂解。裂解液通常是由Tris Tris（hydroxymethyl）aminometh

10、ane，即三羟基甲基氨基甲烷 缓冲液加裂解剂组成，如SDS（Sodium dodecyl sulfate）即十二烷基磺酸钠、CTAB（Hexadecyltrimethyl ammonium bromide）即十六烷基三甲基溴化铵等。,细胞的裂解,.,15,通常使用能使蛋白质变性的试剂，如醋酸钾、醋酸钠、氯仿等。 通常使用RNA酶。,蛋白质的沉淀,RNA的消化,.,16,通常使用冰冻的异丙醇（2-ropanol）、70%乙醇等。 通常使用TE缓冲液（10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0，灭菌）。 EDTA（didodium ethylenediaminetetra-acetate）即

11、乙二胺四乙酸。,DNA沉淀,DNA溶解,.,17,电泳用的凝胶由琼脂糖（agarose）制备，琼脂糖的浓度通常为0.9-1.0%。 酶切后的DNA样品通过电泳，使DNA片段分离,并按分子量的大小排列。,电泳,.,18,DNA从凝胶转移到特制的杂交膜上，常用Hybond N+（Amersham） 的尼龙膜。 凝胶的处理： 脱嘌呤处理：0.25M HCl 变性处理：0.4M NaOH DNA转移： 转移液：0.4M NaOH。 洗膜： 洗膜液：2xSSC缓冲液,杂交膜的制备,.,19,用于RFLP分析的探针（probe）是DNA片段，长度约0.5-2.5kb。探针的来源有：基因组的随机片段、cDN

12、A 等。 探针以克隆的方式保存，以质粒（plasmid）为载体，如pUC19等，通过大肠杆菌繁殖。,.,20,用作载体的质粒必须具备三个特性： 一个复制起始点（Ori）； 一个显性的选择标记，如氨苄青霉素（ampicillin）抗性基因（Ampr）； 单一的限制性酶切位点。,载体,.,21,.,22,利用放射性同位素（32P-dCTP）等对探针进行标记，以跟踪探针。 同位素标记：利用DNA聚合酶（Klenow），在DNA复制的过程中，把32P-dCTP合成到DNA片段上。,探针的标记(labeling),.,23,杂交液 + 鲑精DNA ( sheared salmon sperm DNA,

13、SSS DNA ) 杂交液:20 X SSPE 250 ml 100 X Denhardts 50 ml 10% (w/v) SDS 50 ml Make up to 1000 ml 65C保温，2小时以上。,预杂交,.,24,A. 2X SSC, 0.1% SDS, 65C, 20 min; B. 1X SSC, 0.1% SDS, 65C, 20 min; C. 0.5X SSC, 0.1% SDS, 65C, 20 min,把已标记的探针加入到杂交液中，加入经预杂交的杂交膜。 65C保温，过夜。,杂交,洗膜,.,25,用塑料薄膜把已杂交的杂交膜包起来。放入暗盒中。 放入X光片，紧压。-8

14、0 C冷柜中曝光2-4天。 在暗房中取出X光片，显影、定影、冲冼。,包膜,照射,显影,.,26,A 无表型效应，RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响。B RFLP标记在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。C 在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰。D RFLP标记起源于基因组DNA的自身变异，在数量上几乎不受限制。E DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。,RFLP优点,.,27,但RFLP分析需要比较完善的包括多种酶切、标记、分子杂交等技术的实验室，加上

15、工作量大、成本高以及放射性的问题，使其应用受到了一定的限制。,.,28,A,B,A,B,限制性内切酶位点,与放射性探针 结合部位,限制性内切酶酶切后； 电泳分离DNA片段； 转移至硝酸纤维素薄膜； 与放射性探针杂交， 分析阳性条带,.,29,一）随机扩增多态性（random amplified polymorphism DNA，RAPD）,RAPD是1990年由美国杜邦公司的科学家Williams和加利福尼亚生物研究所Welsh几乎同时发展起来的建立在PCR基础上的一种新型的DNA分子标记技术。,第二类分子标记 以聚合酶链式反应（PCR反应）为核心的分子标记技术,.,30,基本原理,采用随机合

16、成的寡核苷酸（通常10bp）作PCR反应的引物，对所研究生物基因组DNA进行PCR扩增，经过3040个循环，即可得到大量的DNA片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、EB染色、紫外下显示RAPD带纹。,.,31,由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。单一引物与反向重复序列结合。使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。,.,32,技术路线,DNA的提取,PCR反应,凝胶电泳,选择随机引物

17、,图谱分析,.,33,与RFLP的比较,相同之处：都从琼脂糖凝胶上DAN条带的多态性来反映基因结构上的多态性； 不同之处：RFLP用限制性内切酶消化DNA，通过分析限制性酶切片端的多态性，来显示DNA的结构的多态性；而RAPD是利用PCR技术从扩增的DNA片段上分析多态性。由于片段被引物选择地扩增，并不是所有序列都扩增，扩增了的片断能在凝胶上清晰地显现出来，这样就可以通过同种引物扩增条带的多态性，反映出模板的多态性。,.,34,与常规PCR的比较,常规PCR需要两个引物，每个引物分子1530个核苷酸，引物顺序根据扩增的基因两端的顺序设计，因而要进行PCR时，必需知道待扩增基因的顺序； RAPD

18、分析时，只需一个引物，长度10个核苷酸左右，引物顺序是随机的，因而可在对被检对象无任何分子生物学资料的情况下对其基因组进行分析。,.,35,（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息； （2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子； （3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术； （4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低； （5）实验重复性较差，结果可靠性较低。,RAPD标记的主要特点,.,36,RAPD的缺点,RAPD图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记

19、含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离。,.,37,二）扩增片段长度多态性（Amplified restriction fragment polymorphism, AFLP）,AFLP是1993年由荷兰科学家Zabeau等人将PCR与RFLP结合起来，创造了AFLP分析技术。 AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。,.,38,基本原理

20、,首先用限制性内切酶酶解基因组DNA，形成许多大小不等的随机限制性片段；接着在这些片段的两端连接上特定的寡聚核苷酸接头（Oligo nuleotide adapter）；然后根据接头序列设计引物，由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3端加入1-3个选择性碱基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合，成为模板被扩增，从而达到对限制性片段进行选择扩增的目的；最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将这些特异性的扩增产物分离开来。,.,39,.,40,.,41,技术路线,（1）首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是EcoRI或P

21、stI或SacI)。 （2）酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。 （3）DNA片段的预扩增。 （4）在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。 （5）PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。 （6）多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。,.,42,AFLP结合了RFLP与PCR技术的特点，兼具RFLP和RAPD两种方法的特长，既继承了RFLP的稳定性，又具有了PCR反应快速、灵敏的特点，同时克服了RFLP和RAPD的缺点。采用少数几对引物的多种组合即可获得大量遗传信息，避免了RAPD分子标记重复性差、假阳性反应过高等不利因素的影

22、响，同时又无需任何目的基因组DNA的背景资料即可完成模板DNA多态性检测，摆脱了RFLP的转膜、克隆、探针制备、分子杂交等一系列繁重且又有一定难度的工作 。,.,43,用AFLP分析的多态性是典型的孟德尔式遗传和选择中性。它可以用于遗传分析的各个方面：如用于拟南芥属连锁图的构建用于马铃薯的栽培种的鉴定等。AFLP也适于鉴定遗传多样性的物种亲缘关系的研究 。,.,44,（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；（3

23、）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4）分辩率高，结果可靠；（5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。,AFLP特点,.,45,专利技术，试剂盒价格贵 需要同位素或非同位素标记引物，须具特殊防护措施、配套仪器设备 基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以实验对DNA纯度和内切酶的质量要求较高。,缺点,.,46,应用,AFLP具有可靠性好，重复性强，可信度高等优点，近年来广泛应用于遗传育种研究，在动物遗传育种、动物基因组研究中有着广泛的应用前景。 构建遗传连锁图谱 利用AFLP快速鉴别与目的基因紧密连锁的分子标记 AFLP辅助的轮回选择育种 利用AFLP技术研究基因表达与

24、调控 分类和进化研究 甲基化研究,.,47,在AFLP技术的基础上又发展了一种新的分子标记TE2AFLP(三内切酶扩增的限制片段长度多态性, three endonuclease amplified fragment length polymorphism) . 该技术是由荷兰科学家Vander Wurff 等在2000 年末发表的. TE2AFLP也是首先扩增限制性内切酶片段,然后在高分辨率凝胶(通常为序列分析胶) 上电泳分离这些扩增的片段,再根据这些片段的长度来检测DNA多态性。 与AFLP不同的是要用2 种低频率切点内切酶和1 种高频率切点内切酶混合酶切基因组DNA. TE2AFLP保留

25、和发展了AFLP的优点,克服了AFLP 常见的缺点,具有可靠、快速和方便的特点. 因此,它将广泛地被应用。,.,48,三）简单序列重复标记（simple sequence repeat，SSR）,又称微卫星DNA(Micro-satellite DNA)标记； 属高度重复序列，重复单元26bp，如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重复，重复区大多几十几百bp，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫星DNA已经发现了万余个位点。,TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGC AAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTC

26、GTCGTCTCGAACG,.,49,由Moore等于1991年创立。SSR即微卫星DNA，广泛分布于基因组的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重复。不同遗传材料重复次数的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性，即SSR标记。,原理,.,50,微卫星DNA一般位于内含子中，因此它在进化过程中受到选择压力较小，与其他分子标记相比，微卫星在多

27、态性，群体平均杂合度，以及群体间遗传距离等方面，微卫星位点值均高于蛋白质位点，用微卫星作为遗传标记更适合于这些方面的分析，同样也更适于检测个体间的差异，微卫星DNA为共显性遗传，利用PCR及电泳检测相对容易，也更便于实现自动化，可通过计算杂合度，较好的进行个体鉴定。,.,51,建立DNA文库，筛选鉴定微卫星DNA克隆，然后测定这些克隆的侧翼序列，设计特异性引物来扩增SSR序列。后经聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色，通过比较谱带的相对迁移距离，便可知不同个体在某个SSR座位上的多态性。,技术路线,.,52,（1）数量几乎无限，检测出多态性的频率极高； （2）SSR技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位

28、点； （3）SSR标记为共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； （ 4）结果重复性高，稳定可靠。为了提高分辨力，通常使用可检测出单拷贝差异的聚丙烯酰胺凝胶电泳； （5）兼具PCR反应的优点，即所需DNA样品量少，对DNA质量要求亦不苛刻。,优点,必须事先知道微卫星两翼序列信息才能设计引物，对于许多物种需要构建文库。 这将给微卫星标记的开发带来一定的困难。,缺点,.,53,应用,SSR标记在数据上比前述分子标记能显示出更多的多态性，已在遗传疾病的诊断、构建遗传图谱、种质资源鉴定、基因定位及分子标记辅助育种、植物生态学和系统与进化研究等领域得到了广泛的应用 。,微卫星DNA PCR扩增结果（示例）,

29、500bp 400bp 300bp 240bp,该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有四种。,.,54,四）微卫星间隔（Inter simple sequence repeat，ISSR）,Zietkiewicz et al.(1994) 对SSR技术进行了发展，他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物，对基因组节段而不是重复序列本身进行扩增。在SSR的5端或3端加上24个随机选择的核苷酸，这可引起特点位点退火。这样就能导致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为ISSR (inter-simple sequence repeat)。,.,55,基本原理,用锚

30、定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3端或5端加上2-4个随机核昔酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。,.,56,ISSR引物的开发不像SSR引物那样需测序获得SSR两侧的单拷贝序列，开发费用降低。与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不像SSR标记一样具有较强的种特异性;与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP相媲美，检测非常方便，因而是

31、一种非常有发展前途的分子标记。,.,57,目前，ISSR标记已广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中。 但是由于不知道目的基因组DNA的背景资料，有一些ISSR引物可能在特定基因组DNA中没有配对区域而无扩增产物。而且ISSR也是一种显性标记，模板浓度需要较一致，最适反应条件需要一定时间摸索。,.,58,ISSR与RAPD技术很相似，引物和镁离子浓度以及退火温度明显地影响扩增带的式样，Taq聚合酶的活性也会影响PCR扩增结果。一般来讲所研究的基因组DNA越复杂，重复序列的密度越高，对引物的专一性要求就越高，运行PCR的条件也越严格。 ISSR引物对Mg2

32、+ 浓度的敏感度大于RAPD，由于引物与模板的双链杂交体的解链与退火温度受二价阳离子的影响；游离的Mg2+ 用来增强DNA聚合酶的活性，它也可与dNTP中磷酸基结合，而Mg2+ 和dNTP在PCR扩增过程中相互作用，只有Mg2+ 和dNTP的浓度在合适范围内，才能得到好的PCR扩增结果。,.,59,在PCR扩增反应中，退火温度的影响最大。一般在运行ISSRPCR时，采用4852退火温度都能得到好的扩增带。Virk et al的研究中退火温度控制在3959之间也能扩增出好的带谱。但不同的引物在不同的物种中所需的退火温度是不同的，对ISSR引物来说，可适当提高其退火温度得到稳定清晰的带谱。,.,6

33、0,a.引物 PCR结果的特异性取决于引物的特异性，扩增产物的大小也是由特异引物限定的。因此，PCR所用引物质量要高，且需纯化。PCR反应中引物的量也影响PCR扩增效果，当PCR引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性。引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。,PCR反应条件,PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+,.,61,b. 酶 该酶的最适温度很高（79），使引物在高温下进行退火和延伸，这样便增加了反应的总强度并减少了与错配引物的延伸。在PCR反应中，每100l反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳

34、，酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。Taq DNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的常见原因。,.,62,c. d NTP 四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反应中dNTP含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过高的dNTP浓度会导致聚合将其错误掺入，因此应当避免。,.,63,d. 模板 PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。不同来源的核酸标本必须经处理后才能用于PCR的扩增，处理不当或处理过程中DNA掉失都会导致PCR

35、扩增失败。采集标本方法不当，未能获得所要检测的靶DNA都会导致出现假阴性。但是如果待扩增标本中模板DNA浓度太高也会导致扩增失败。,.,64,e. Mg2+ Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性，这是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它还影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。,.,65,1. 分子遗传图谱的构建 目前几乎所有重要农作物，如拟南芥、番茄、玉米、水稻、甜菜、小麦、大豆、马铃薯、棉花、油菜等的RFLP图谱均已构成，随着多种标记的不断添加与定位，分子遗传图谱正日

36、渐趋于饱和。 遗传图谱对于基因定位至关重要，图谱上包括的标记数越多，分布越均匀，则基因定位就越精细。高密度分子遗传图谱的绘制使一些植物的遗传学研究取得了重大进展，并对分子标记辅助育种选择技术和基因图位克隆技术的发展产生了巨大的推动作用。,第一、二类分子标记的应用,.,66,2. 遗传多样性与种质鉴定 分子标记广泛存在于基因组DNA的各个区域，数量巨大，通过对随机分布于整个基因组的分子标记的多态性进行比较，就能够全面评估研究对象的多样性，并揭示其遗传本质。利用遗传多样性的结果可以对种质进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系。而以分子标记为基础的比较基因组研究则有利于探明近缘物种间的遗传同源性

37、以及物种起源等生命科学领域中的重要问题。,.,67,微卫星标记等具有很高的多态性，可以用于鉴别同一物种的不同基因型，如Olufowote等选择4个SSR标记即可有效地评估栽培稻内不同品种间的异质性；Guifford等用3个SSR标记就能区分21个苹果品种。分子标记的这一特点还可用于鉴别品种的混杂情况和真假杂种的判断等。,.,68,3.重要农艺性状相关基因的定位 基因定位就是确定基因在染色体上的位置及与之相连锁的分子标记，高密度分子遗传图谱的构建使基因定位工作变得相对容易。 目前已完成了重要作物大量控制农艺性状表现如抗病性、抗虫性、育性等的主基因的定位工作，为开展这些基因的分子育种奠定了基础。,

38、.,69,尤为重要的是分子标记技术为呈数量遗传、易受环境条件影响的重要农艺性状的QTL定位提供了有效手段，目前涉及到QTL图谱绘制及大量复杂的数据统计、分析、运算工作已有多个配套的计算机软件被开发出来。QTL的定位使得控制数量性状的多基因被转变成一个个独立的“主基因”，便于进行遗传操作，这无疑有利于对产量、生育期等性状的定向改良。,.,70,4.分子标记辅助选择 选择是育种的重要环节，传统育种对目标性状多采用直接选择的方法，但作物的许多农艺性状不容易观测或易受环境影响、表现不稳定，直接选择比较困难。而在完成基因的分子标记定位后，就可以通过连锁标记对这些性状进行间接选择，从而提高它们的选择效率。

39、,.,71,与传统选择相比，分子标记辅助选择有许多显著的优点，主要体现在：（1）可以清除同一座位不同等位基因间或不同座位间互作的干扰，消除环境的影响；（2）在幼苗阶段就可以对在成熟期表达的性状进行鉴定，如果实性状、雄性不育等；（3）可有效地对表型鉴定十分困难的性状进行鉴定，如抗病性、根部性状等；（4）共显性标记可区分纯合体和杂合体，不需下代再鉴定；（5）可同时对多个性状进行选择，开展聚合育种，快速完成对多个目标性状的同时改良；（6）加速回交育种进程，克服不良性状连锁，有利于导入远缘优良基因。,.,72,将分子标记辅助选择应用于作物改良的实践中，已取得一些实质性进展。如国际水稻所利用与Xa-4，

40、xa-5，xa-13和Xa-21四个抗白叶枯病基因连锁的STS标记辅助选择，成功地将这四个基因以不同组合方式聚合在一起，育成了高抗、多抗白叶枯病水稻新品种。,.,73,5.重要农艺性状的图位克隆 图位克隆（Map-based cloning）是近几年随着植物分子标记遗传图谱的相继建立和基因分子定位而发展起来的一种新的基因克隆技术。利用分子标记辅助的图位克隆无须事先知道基因的DNA序列，也不用了解基因的表达产物是什么就可以直接克隆基因。,.,74,一）单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism， SNP),1. 定义 单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平

41、上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 不同个体间，基因组DNA某部位的单核苷酸的变异。 1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性 标记（single nucleotid polymorphism SNP）。是 第三代遗传标记。,第三类分子标记技术以DNA序列分析为核心,.,75,SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，估计其总数可达1700万个甚至更多。 在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(coding sNP,cSNP)比较少，因为在外显子内

42、，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。,.,76,SNP与RFLP和STR标记的主要不同之处在于，它不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记。,.,77,.,78,SNP的优点,(1) SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。 (2)它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。 (3)与串联重复的微卫星位点相比，SNP是高度稳定的，尤其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。 (4)部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基

43、因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。 (5)易于进行自动化分析，缩短了研究时间。,.,79,日本研究人员最近经过研究发现，与糖尿病有关的基因并不是千篇一律，它们之间存在着个人差别，即“单核苷酸多态性”（SNP）。,.,80,EST是cDNA的部分序列，平均长度为300500bp，由大规模cDNA克隆一次测序得到，因此称作表达序列标签。通常是从已有的cDNA文库中随机取出几百到几千个克隆一次测序产生。一般使用载体多克隆位点互补序列作为通用引物。一个EST代表生物体某种组织某一时期的一个表达基因。 EST目前主要被用于寻找新基因和了解基因表达概况。,二）表达序列标签 （e

44、xpressed sequence tag， EST ）,.,81,一般步骤如下： 建立组织或细胞的cDNA文库从文库中随机取出足够量的cDNA克隆进行自动测序生物信息学分析（即将所得的EST数据与dbEST等数据库的数据比较，确定哪些代表已知基因、哪些代表未知基因） 进一步分析未知基因或归类分析全部EST以获得组织或细胞的基因表达概况。,.,82,SRAP是一种新型的基于PCR的标记系统，由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士于2001年提出，又叫基于序列扩增多态性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP）。,三）相关序列扩增多态性 (s

45、equence-related amplified polymorphism, SRAP),.,83,引物设计是SRAP分析的核心。SRAP标记分析共有两套引物。在一组正向SRAP引物中使用“CCGG”序列，其目的是使之特异结合可译框（ORFs）区域中的外显子。运用CCGG序列就可特异扩增出包含这些组分的序列。 由于外显子序列在不同个体中通常是保守的，这种低水平多态性限制了将它们做为标记的来源。由于内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大，富含AT的区域序列通常见于启动子和内含子中，SRAP中使用的反向引物的3端含有核心AATT，以特异结合富含AT区，这就使得有可能扩增出基于内

46、含子与外显子的SRAP多态性标记。,SRAP标记引物设计原理,.,84,引物大小和引物组合是成功进行SRAP分析的关键。SRAP-PCR反应体系中使用两个引物：17碱基正向引物（F-primer）和18碱基反向引物(R-primer)；正向引物含有一段14碱基的核心序列（core sequence）：5端前10个碱基为“填充”序列（filler sequence），无任何特异组成，接着为CCGG序列；随后为3 端的3个选择性碱基，选择性碱基的变化与相同核心序列组合成一套正向引物。反向引物的组成与正向引物类似，但“填充”序列后连接的为AATT；AATT序列后为3个选择性可变碱基，位于引物3 端。

47、 构建正向与反向引物的总体要求是它们不形成发夹结构及其他二级结构，且CG含量为40%50%，且两者“填充”序列在组成上必须不同，长度为10或11个碱基。,引物设计,.,85,由于在设计引物时正反引物分别是针对序列相对保守的编码区与变异大的内含子、启动子和间隔序列，因此，多数SRAP标记在基因组中分布是均匀的。SRAP标记测序显示多数标记为外显子区域。 SRAP多态性产生于两个方面：由于小的插入与缺失导致片段大小改变，而产生共显性标记；核苷酸改变影响引物的结合位点，导致显性标记产生。,SRAP标记特征,.,86,TRAP也是一种新型的基于PCR标记，由美国农部北方作物科学实验室Hu与Vick于2

48、003年提出。,四）靶位区域扩增多态性 (target region amplified polymorphism，TRAP),与SRAP、RAPD和AFLP等标记技术无须任何序列信息即可直接PCR扩增不同，TRAP技术是基于已知的cDNA 或EST序列信息。 目前已获得许多物种基因组序列的丰富信息，包括人类、拟南芥，以及重要作物水稻和多种微生物的基因组序列草图绘制成功，有大量的EST序列可供使用，从而使得可以利用生物信息学工具和EST数据库信息产生出许多靶基因序列的TRAP多态性标记，而且极易将性状与标记相关联。,.,87,TRAP技术是从SRAP技术改进而来的。SRAP使用两个任意引物；而

49、TRAP是使用长度为1620核苷的固定引物（fixed primer）与任意引物(arbitrary prime)，固定引物以公用数据库中的靶EST序列设计而来；任意引物与SRAP所用的一样，为一段以富含AT或GC为核心、可与内含子或外显子区配对的随机序列。,.,88,从EST数据库中鉴别所需序列，再采用有关引物设计软件（如Primer3等） 设定核苷酸序列合理长度（18碱基）与最适、最大和最小Tm值（53、55、50），最后选定最适的引物; 任意引物设计完全同SRAP技术。TRAP-PCR反应条件与SRAP-PCR完全一致。每次TRAP-PCR反应在6.5%聚丙烯酰胺测序胶可产生50900bp的片段30-50 个。,固定引物的设计步骤,.,89,SRAP分子标记系统最早是在芸薹属作物开发出来。目前已在其他作物如马铃薯、水稻、生菜、油菜、大蒜、苹果、樱桃、柑橘与芹菜中也成功扩增。TRAP技术是在向日葵中开发的，