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1、T细胞对胰岛细胞凋亡及相关基因表达的影响第26卷第8期20o6年8月南京医科大学(自然科学版)ACTAUNIVERSITATISMEDICINAUSNANJING(NaturalScience)?613?T细胞对胰岛细胞凋亡及相关基因表达的影响董丽,刘超,刘翠萍,徐宽枫,茅晓东(南京医科大学第一附属医院内分泌科,江苏南京210029)摘要目的:观察T细胞对大鼠胰岛瘤细胞系RINm5f凋亡及凋亡相关基因表达的影响.方法:应用PI法检测T细胞与RINm5f共培养后RINm5f细胞的凋亡率;应用半定量Rrr_PCR技术检测培养后bc1.2,bax,p53和fasmRNA的表达.结果:PHA与T细胞均
2、可致胰岛细胞的凋亡,且P,T具有协同效应,P或T或两者联合应用均呈时间依赖性地促进RINm5f细胞的凋亡;胰岛细胞凋亡过程中,P,T可协同致诱导凋亡基因bax,fasmRNA表达水平明显升高,而抗凋亡基因bc1.2及p53mRNA表达水平有下降趋势,但统计学无显着性差异.结论:T细胞可通过诱导胰岛细胞凋亡导致或加重胰岛移植排斥反应,其机制可能与凋亡基因与抗凋亡基因的表达比率变化有关,其中fas,bax诱导凋亡基因可能起主要作用.【关键词RINm5f细胞;凋亡;凋亡基因中图分类号R587.1文献标识码A文章编号1007-4368(2006)08.061304EffectsofTcellonthe
3、apoptosisandexpressionofapop,.osis-relatedgenesofRINm5fisletcellsDONGLi,LIUChao,LIUCuiping,XUKuanfeng,MAOXiaodong(DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospitalofNJMU,Nanjing210029,China)AbstractObjective:ToinvestigatetheeffectsofTcellontheapoptosisandexpressionofapoptosis?relatedgenesofRINm5f
4、isletcells.Methods:ApoptoticcellswereidentifiedbyPImethod.ThemRNAlevelsofbcl一2,bax,p53andfaswereevaluatedbythemethodofsemi.quantitativeRT.PCR.Results:PHA,TcellsorPHAcombinedwithTcellscausedtime.dependentincreaseofapoptosisrate.Intheprocessofapoptosis,PHAcombinedwithTcellscouldinducesignificantincrea
5、seofmRNAlevelofbaxandfas.Theexpressionofbcl一2andp53mRNAwasdecreasedwithnostatisticalsignificance.Conclusion:TheTcellmayinitiateandexacerbatetherejectionofislettransplantation.Thechangesoftheratioofinducibleapoptosistoantiapoptosisgenesmayberelevanttothemechanismsofapoptosisandfasandbaxgenesplayanimp
6、ortantroleintheapoptosisprocess.KeywordsRINm5fcell;apoptosis;apoptoticgeneActaUnivMedNanjing,2006,26(8):613616自1997年Edmonton方案诞生以来,胰岛移植取得了可喜的成绩,但还存在许多问题.尤其在减轻免疫排斥反应反面,至今没有很好的解决方法.目前的研究主要着眼于开发免疫抑制药物,对于胰岛移植免疫排斥反应的细胞及分子机制研究涉足不深.本研究主要通过AnnextinV/PI双标法及PI法观察活化T细胞与胰岛细胞共培养后对RINm5f细胞凋亡的影响,同时利用半定量RT-PCR检测胰岛凋
7、基金项目江苏省政府医学重点学科资助项目(200134)通讯作者,Email:liuchaonfmcn.tom亡相关基因bcl一2,bax,p53和fasmRNA的表达,探讨T细胞引起胰岛细胞凋亡的机制,为治疗胰岛移植后发生的免疫排斥反应提供新思路.1材料与方法1.1材料清洁级SD雄性大鼠,体重150200g,由南京医科大学动物中心提供.RINm5f细胞株由南京医科大学基因组学实验室韩晓教授提供.AnnextinV/PI试剂盒由南京市儿童医院细胞免疫室提供.Trizol购自美国罗氏公司.RT.PCR试剂盒购自美国?614?南京医科大学第26卷第8期2006年8月Promega公司.PUC19DN
8、A梯度标记物为美国Promega公司产品.超净台(苏州净化设备厂生产);CO2培养箱(Type4型,Heraeus公司,德国);倒置相差显微镜(Olympus,美国),PTC-200PCR仪.1.2方法1,2.1RINm5f细胞的培养与传代RINm5f细胞予1640营养液培养,待细胞密度至80%左右时,吸去培养瓶中的上清液,加入消化液(0.25%胰酶+0.02%EDTA)3ml,放人5%C0237oC孵箱中消化50秒,用冷Hanks液终止消化,移人离心管后,1200r/rain离心5rain,弃上清,加入1640营养液少许,吹打混匀,用0.4%台盼兰染色,观察细胞活性,要求活细胞数大于95%,
9、再加入适量1640培养液,按1:3分别装入50ml无菌细胞培养瓶中,置于孵箱中孵育.1.2.2大鼠T细胞的分离,纯化与活化大鼠禁食16h后,腹腔麻醉,暴露脾脏后迅速取出立即放人冷Hanks液中,研磨脾脏,加入裂解液裂解红细胞约5rain后.1500drain离心10rain后,弃上清,过尼龙毛柱孵育60rain,离心得到T细胞.取约5X10s细胞,标记大鼠CD3单抗,在流式细胞仪上检测T细胞的纯度.在6孑L板内以4X1孑L接种RINm5f细胞,共设立4组.分别为RINm5f细胞组(简写为R组),RINm5f十PHA(终浓度为10Ixg/ml,简写为R+P组),llINm5f+T细胞组(T细胞与
10、RINm5f细胞比例为10:1,简写为R+T组).RINm5f+T细胞+PHA组(简写为R+P+T组),培养12,24,48h后,胰酶消化离心后,PBS洗3次后流式细胞仪检测凋亡率.1.2.3提取R.INm5f细胞总RNA四组细胞培养12,24,48h后,胰酶消化RINm5f细胞,离心后得到细胞沉淀,加入zol液充分混匀,室温放置5rain,加入氯仿离心,转移上层无色水相,在加人异丙醇后离心,沉淀llNA,再加入75%乙醇洗去以上有机溶剂,最后加入无RNA酶水,充分溶解RNA,经分光光度计检测RNA的纯度与含量,A260/A280比值在1.61.8之间,提取的RNA一80保存.1.2.4R.T
11、-PCR法检测凋亡相关基因bax,bcl-2的表达RNA以Oligo(dT)为引物,在逆转录酶作用下合成eDNA第1链.用待检基因特异性引物在TaqDNA聚合酶作用下行PCR反应,首先确定待测基因PCR反应动力学参数,其中包括引物浓度,退火温度和PCR循环数等,在此基础上行PCR反应.反应产物在1.5%的琼脂糖凝胶中90V稳压电泳3035rain.将电泳产物用KodakDigital1DImageAnalysisSoftware成像系统扫描.测定光密度值.待测基因引物设计为:BAX上游引物5一CTGAGCT.GACCTrGGAGC一3.下游引物5.GACTCCAGCCA.CAAAGATG.3.
12、Bc1.2上游引物5.ACACCAGAATCAAGTGTrCGTCA一3.下游引物5.GAAGCT.GCAGGTACCAATAGCAC.3:FAS上游引物5.CATrCAGAAGAGAGCATGGGAA.3.下游引物5一CGGGCCTrGCATAC111AAACA.3:P53上游引物5.AGAGACCCAGCAACTACCAACC.3.下游引物5.CTCAGACTGACAGCCTCTGCAT.3:GAPDH上游引物5.CACCCTGGCTGTAGCCATATrC.3,下游引物5.GACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG.3.1.3统计学处理所有数据均用均数标准差(s)表示,统计学分析采
13、用析因设计的方差分析(Stata8.0统计软件).显着性差异标准为P<0.05.2结果2.1T细胞对RINm5f细胞凋亡的影响见表14及图14.表1与T细胞共培养12h后各组I江Mm5f细胞凋亡率的变化表2与T细胞共培养24h后各组I江MrnSf细胞凋亡率的变化表3与T细胞共培养48h后各组I江Mm5f细胞凋亡率的变化帮26誊椎8刺20)6印8JJ啦f等:.IjIJR对脯岛湘胞搁旦把是坫丧j立的l响-615帐州析ljf分析结粜?iJ铝l:PH或T细胞IWIm5f辟乜共有后均f使雌岛细抛曲搦e率卧高;PIIAjT抛雌应lII则Jtl同敛直:PHA或r细胞或阿扦城台?Nm5I胞育J-.细胞呐
14、拥1率时Itij侬赖性计l商I3分圳为IllNm5f细胞PHA硬T细胞北培养I224&481J.f1l流式细胞仪愉测的RINm5f细胞lgJ蒯r宰.lI峤乜峰为凋1,峰.扶r叮姒彳子.f;jfi叫flJ的延【乏,制峰的峰还1瑚升高.2._9T细胞时I/m51细盹渊亡韶关基因bax,卜2,Ias及3的影响iI?PIIA吐.r胞!冉车I2i川,mSI旧州r-#【纠2?I土lIlJj.牛24hlINm5ff1.叫:争I30l】HA磕I细胞精诈48h再HlNm5t的毕如4所尔.L谜4卦【细胞J养48h后,P,T联合作用I1f致弑岛细胞x$mllN表达水平lJJjft高.币抗稠基ll一2髓p53
15、mllNA表达水平有下降趋.但无统学意l殳L述4种荩冈的Pll与T细胞的交互怍州l550I3ll911I10冒_|,l_;茏2施磁磊荔g二:I234淋厄计ll1.1十l.川I1+I【l盟+Pli4?r胞典肯48hRINm5f圳lI乜FBf:l一2p53琏Hx坫矗迅的变化rn.I一1,m.l搬(114453.【cI1.I十jl.IlIf一:J:一lII一卜II.ii十lcI2P53ItXl:木,11111.一J:川PIIA5m:I2153rASRAx墙的】HA0I胞帕尘怍川I-圈阻强豳翻暖嚣孽钎?616?南京医科大学第26卷第8期2006年8月3讨论移植分泌胰岛素的细胞,组织及器官是治疗1型糖尿
16、病的有效方法2.胰腺移植因其手术复杂,创伤大及死亡率高等原因逐渐被胰岛移植所替代.但供体短缺及排斥反应目前仍然是制约胰岛移植被广泛应用于临床的主要障碍.一般认为,由T淋巴细胞和巨噬细胞介导的细胞免疫激活是异种移植排斥反应的主要原因,大鼠,猪和人的胰岛均可在裸鼠体内生长并具有功能活性.说明T细胞是影响受体免疫排斥反应的主要因素.其中CD4T细胞4起了主要作用.受体使用环孢素A及抗淋巴细胞血清能延长移植物的存活也支持这一观点.然而,使用能阻止T细胞反应的常用免疫抑制剂仅能延长异种胰岛的存活时间,而不能完全阻止免疫排斥反应5发生.但目前对于T细胞引起免疫排斥反应的机制6还不甚清楚.本研究将T细胞与R
17、INm5f细胞共培养l2,24及48h后.发现单独用PHA或T细胞,均可使胰岛细胞的凋亡率升高.而PHA与T细胞联合应用,则具有协同效应,提示PHA致T细胞活化后分泌大量的细胞因子使胰岛细胞的凋亡率明显升高.结果提示无论是P,T或P与T联合与时间因素均具有协同效应,三组细胞的凋亡率随时间的延长都明显升高.上述结果提示胰岛移植后移植物的功能丧失可能与T细胞活化介导的细胞凋亡密切相关.关于PHA刺激T细胞活化后引起胰岛细胞凋亡的分子机制目前国内外的报道还较少.我们的研究显示bcl一2/baxmRNA表达比率的变化_7在细胞凋亡中起着非常重要的调节作用.本研究结果显示,PHA,T细胞与RINm5f细
18、胞联合培养后.胰岛细胞凋亡的同时伴有FAS及BAX表达水平的升高.BCL一2,P53表达水平有下降的趋势,但统计学无显着性差异.考虑可能与样本数少有关,在整个胰岛细胞凋亡过程中,诱导凋亡基因表达上调,抗凋亡基因水平下降.这一变化_8与多种其他细胞发生凋亡的变化相似,本研究的结果还提示胰岛凋亡过程中FAS及BAX等凋亡基因可能起更重要的作用.根据上述结果.我们的研究认为.T细胞与RINm5f细胞共培养后所致的胰岛细胞凋亡的作用机制可能与T细胞或其活化后分泌的细胞因子抑制胰岛细胞长寿基因表达和提高促凋亡基因表达9有关,其中FAS及BAX基因表达上调可能在胰岛细胞凋亡中起更重要的作用,抗凋亡基因BC
19、L.2,P53可能也起一定的作用.本研究为胰岛移植的排斥反应机制及移植后胰岛细胞的进行性衰竭提供了新的解释.提示可通过阻断T细胞的活化1.或应用阻断性单抗抑制其分泌的细胞因子的活性1.对减少排斥反应.提高移植物的存活率具有十分重要的意义.还为糖尿病的基因治疗提供了新思路.运用反义技术阻断促凋亡基因,或将长寿基因转染到胰岛B细胞上,使该细胞能抵抗凋亡I2.有望提高胰岛细胞移植的效果.【参考文献1ShapiroAM,LakeyJR,RyanEA,eta1.Islettransplanta-tioninsevenpatientswithtype1diabetesmellitususingagluco
20、corticoid-freeimmunosuppressiveregimenJ.NEnglJMed,2000,343(4):230-2382NirT,DorY.Howtomakepancreaticbetacells-prospectsforcelltherapyindiabetesJ.CurrOpinBiotechnol,20o5,16(5):524.5293ShounanYi,WayneJ.Hawthorne,eta1.Tcell-activatedmacrophagesarecapableofbothrecognitionandrejec-tionofpancreaticisletxen
21、ograftsJ.JImmunol,2003,170:2750-27584FriedmanT,SmithRN,ColvinRB,eta1.AcriticalroleforhumanCD4T-cellsinrejectionofporcineisletcellxenograftsJ.Diabetes,1999,48:2340-23485AndereggenE,BuhlerL,FournierB,eta1.Immunohisto-logicalstudyofisletxenograftrejectioninimmunosup-pressedrecipientsJ.TransplantProc,19
22、96,28:826-8286NickD,CherryI,ClareH,eta1.Differentialsusceptibilityofheart,skin,andisletallograftstoTcellmediatedrejectionJ.JImmunol,200l,166:282428307HeermeierK,BenedictM,LiM,eta1.BaxandBclxSareinducedattheonsetofapoptosisininvolutingmanmaryepithelialcellsJ.MechDev,1996,56:1972078ThomasD,YangH,Boffa
23、DJ,eta1.ProapoptoticBaxishyperexpressedinisolatedhumanisletscomparedwithantiapoptoticBcl一2J.Transplantation,2002,74(11):148914969HankeJ.ApoptosisinculturedratisletsoflangerhansandoccuenceofBcl-2,Bak,Bax,FasandFasligandJ.CellsTissuesOrgans,2001,169(2):l13-12410MalloneR,NepomGT.TargetingTlymphocytesfo
24、rim-munemonitoringandinterventioninautoimmunediabetesJ.AmJTher,2005,12(6):53455011AmoliMM,LarijaniB.w0uldblockageofcytokinesim-provetheoutcomeofpancreaticislettransplantationJ?MedHypotheses,2006,66(4):81681912VanLinthoutS,MadedduP.ExvivogenetransferforimprovementoftransplantedpancreaticisletviabilityandfunctionJ.CurrPharmDes,2005,l1(22):29272940收稿日期20051207(下转第635页)