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1、精品文档介导性 shRNA 能抑制肺癌细胞中 livin 沉默基因的表达从而促进 SGC-7901 细胞凋亡背景 由于肿瘤细胞抑制凋亡增殖 ,特定凋亡的抑制因素会对于发展新的治 疗策略提供一个合理途径。 Livin 是一种凋亡抑制蛋白家族成员， 在多种恶性肿瘤 的表达中具有意义。但是 , 在有关胃癌方面没有可利用的数据。在本研究中 ,我们 发现 livin 基因在人类胃癌中的表达并调查了介导的 shRNA 能抑制肺癌细胞中 livin 沉默基因的表达，从而促进 SGC-7901 细胞凋亡。方法 mRNA 及蛋白质 livin 基因的表达用逆转录聚合酶链反应技术及西方 吸干化验进行了分析。小干扰
2、RNA真核表达载体具体到livin基因采用基因重组、 测序核酸。然后用 Lipofectamin2000 转染进入 SGC-7901 细胞。逆转录聚合酶链 反应技术和西方吸干化验用来验证的livin基因在SGC-7901细胞中使沉默基因生 效。所得到的稳定的复制品用 G418 来筛选。细胞凋亡用应用流式细胞仪 (FCM) 来评估。细胞生长状态和 5-FU的50%抑制浓度(IC50)和顺铂都由MTT比色法来 决定。结果一livin mRNA和蛋白质的表达检测 40例中有19例(47.5%)有胃癌和 SGC-7901 细胞。没有 livin 基因表达的是在肿瘤邻近组织和良性胃溃疡病灶。相 关发现在
3、 livin 基因的表达和肿瘤的微小分化和淋巴结转移一样(P 0.05)。 4个小干扰 RNA 真核表达矢量具体到基因重组的 livin 基因建立。 其中之一 ,能有效地减 少 livin 基因的表达 ,抑制基因不少于 70%(P 0.01)。重组的质粒被提取和转染到 胃癌细胞。G418筛选所得到的稳定的复制品被放大讲究。当livin基因沉默，胃癌 细胞的生殖活动明显低于对照组(P 0.05)。研究还表明,IC50上的5-Fu和顺铂在 胃癌细胞的治疗上是通过 shRNA 减少以及刺激这些细胞 (5-Fu proapoptotic 和顺 铂)(P 0.01)。结论一livin基因在胃癌中的过分表
4、达与肿瘤分化与淋巴结转移建立联系 ，建 议了治疗胃癌病例分子预后因素之一。 ShRNA 可以抑制在 SGC-7901 细胞中的 livin 基因表达,诱导细胞凋亡。 Livin 可以作为治疗胃癌凋亡的新目标。1 介绍胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。 大多数患者被诊断为这个疾病的阶段 , 在最佳时间的机会错失了手术治愈。 尽管有很大改善 ,但处于晚期胃癌的化疗患者 的总体存活率仍然很低。癌症细胞化疗耐抗性可能导致手术失败。在耐药的原因 中,抑制细胞凋亡的过程会起重要作用。 癌细胞常有抗凋亡增长的特征 1 ,介导其增 加的阻力不同来刺激的细胞凋亡，如DNA损伤、缺氧、营养损失2、3。此外，在临
5、床实践中细胞凋亡抵抗被认为是肿瘤手术失败的主要原因 ,因此许多化疗药物和 /或放射线疗法都是通过诱导凋亡肿瘤死亡实现的 4。酶抑制剂（lAPs）,是一种新型的凋亡蛋白抑制基因家族5,6,包括病毒感染,化疗药物，生长因子和肿瘤坏死因子-a（TNFa凋亡信号通路” Fas信号通路7 - 9。 lAPs是由一组有凋亡特性的结构相关的蛋白质构成10，在预防肿瘤细胞凋亡方面 可能扮演一个重要的角色 ,并已成为近年来研究的热点。这个家庭的新成员是 ML-IAP/livin/KIAP/BIRC7 （以下称为 livin）有两个种类、livin 和 livin 1-14。 有证据表明, livin 的过分表达
6、能阻止 由多种刺激诱导的细胞凋亡 12。有趣的是, livin 基因被发现在肿瘤细胞中限制性表达,但是不存在或是很少数量存在于正常成人体组织中 11-15,并且通过允许恶性细胞 ,以避免凋亡细胞死亡的方式导致肿瘤 形成,。所以抑制 livin 基因表达可能会呈现出一个有趣的治疗策略。在目前的研究中，我们调查了 livin的表达在胃cancinomas及其邻近组织。livin 的表达和临床病理参数之间的关系进行了分析。此外 ,我们探索了在抑制 livin 基 因表达的shRNA可行性和胃癌易感性的凋亡细胞由 shRNA介导的livin沉默基 因。2患者和方法2.1 患者和肿瘤样本胃癌中四十个病例
7、及接受胃切除手术的患者收集到的胃癌组织中 13 个病例 （患者年龄从 2977岁）。其中良性胃溃疡的 13个病例（慢性浅表胃炎 ）患者在接受 了胃内视镜检查 （患者年龄从 3377岁）。这些病例均来自南京医科大学第一附属 医院。胃癌患者被诊断为TNM级的14阶段（UICC , 2002）。手术之后肿瘤标本 就立即被冻结在液态氮中，储存在-80C直到使用为止。这是在所有的病人知情同 意的情况下获得的。2.2逆转录聚合酶链反应技术程序总共RNA（2毫克）提取冷冻组织反转录进行，最后的体积2微升是用100 pmol of oligo（dT）15和200U M-MLV与逆转录酶（promega美国），
8、根据制造商的说明。Aliquots对应的250微升cDNA被放大在PCR缓冲容器中，在最终的50微 升中含25pmol / ml处理剂和1U聚合酶。每一个放大了 35周期，一个周期的变性 曲线在30 s内到达94C。热处理在 30s内59C（ livin and b-actin）扩大到30s内 72C。没有RNA的病例作为阴性对照物包含在 RT -PCR中。一系列常用的的livin和 伕actin处理剂如下：livin a B upstream 5-TCCACAGTGTGCAGGAGACT-3-TCCACAGTGTGCAGGAGACT-3-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3-AGCG
9、CAAGTACTCCGTGTG-3产品的尺寸分别为;livin a/Bdownstream;5; B-actin upstream,5B-actindownstream,5 a是B312/258 bp ,livin3-actin 是 501bp。2.3 西方吸干技术分析病变同质性与冲力缓冲 50mM Tris-HCl （pH 7.5）, 250 mM NaCl,0.1% NP40 和 5mM EGTA包含50mM氟化钠，60mM B-丙三醇-磷酸盐,0.5mM钒酸钠,0.1mM苯 甲基磺醯化氟10卩g/ml亮抑蛋白酶肽。用考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量。 蛋白质样品电泳10%变性SDS凝胶
10、并转移到PVDF膜（Roche、美国）。 膜是培养特定的主要的抗体 ,与过氧化物酶继发性抗体反应（细胞信号技术、 美国）,最后通过增强化学荧光达到可视化（细胞信号技术、美国）。Alexesis（美国）和散塔克鲁兹生物技术 （美国）购买的单克隆抗体 livin （1:250） and actin （1:400） 24 细胞系和细胞培养我们选了一个人类胃腺癌细胞系在这一研究中。 SGC-7901（上海细胞研究所, 中国上海,）是一种附着中度分化胃腺的人类细胞株。线是胃癌细胞上皮细胞 ,并成 长为附着细胞 RPMI 1640 （Hyclone Inc, USA）含 10%FCS （Life Tech
11、nologies, Inc.）, 每毫升 1 00个单位的青霉素和毫升 1 00微克的链霉素 （BioWhittaker） 。在含有5%CO2空气的条件下的37C湿润培养器中保存SGC-7901细胞。溶解顺 铂和氟尿嘧啶（齐鲁制药厂、中国）在DMSO并且4C储存。2.5。ShRNA的合成和PGPU / GFP /Neo/livin质粒的制造通过siRNASequence-Selecto软件设计并合成了 Livin的ShRNA序列（上海生物 技术有限责任公司。 集团公司、 中 国 ）。 序列如下（表1）,然后被插入 pGPU/GFP/Neo（上海GenePharm股份有限公司。中国）BbsI a
12、nd BamH地址产生 pGPU/GFP/Neo/livin and pGPU/GFP/Neo/Co ntro质子。2.6SGC-7901的建立稳定表达 pGPU/GFP/Neo/livin and pGPU/GFP/Neo/Control转 染实验,SGC-7901细胞被镀成6孔板（3为05孔密度）,96孔板（1 104孔密度）和12孔 板（1.5 105孔密度）转染之前培养 24小时。按照制造商的说明这些细胞被调控子用 Li-pofectAMINE 2000转染4毫克/孔 空的 pGPU/GFP/Neo/vector, pGPU/GFP/Neo/livi n 或 pGPU/GFP/Neo/
13、C on trol 质粒 （生命技术公司、大岛屿,NY）。转染48小时后，这些细胞被转移在 1:15 （v/v）并用 Geneticin （G418） 1000克/毫升培养4周。稳定转染的克隆体取出并保存在媒介容器 400 g/ml G418用作另外的研究。27 依赖贴壁细胞细胞生长的测定亲本 细胞和 细胞稳 定表达 pGPU/GFP/Neo/vector, pGPU/GFP/Neo/livin or pGPU/GFP/Neo/Control被种到6孔盘子中。每隔一天收集三孔的细胞。使用计数器 确定细胞数目（Coulter Electronics, Miami, FL）.。种植一些天数后用平均
14、SD记录每 孔细胞的数量。2.8MTT 测定通过 MTT 对细胞毒性进行了测量。 呈几何数增长的细胞被镀在密度为 10000 细胞/孔的 96 孔板上作用 24 小时。接下来这些细胞被以不同浓度的药物治疗48小时。每孔加入100微升MTT溶液（1毫克/毫升）,并且这些细胞放在37C下培养 四小时。上层清液用异丙醇代替溶解有色甲品。用 micro-ELISA 测量到吸光率的 波长为 595nm（ClinBio-128 SLT, ,奥地利 ）。治疗细胞的吸光率相当于计算控制细胞 的吸光率并用细胞死亡百分率显示出来。2.9 流式细胞术细胞被收集并加入冰冷的70%乙醇于PBS缓冲液中储存在-4摄C暖直
15、到使用。 悬浮后后，100 ml核糖核酸酶I （1 mg/ml） and 100 ml的聚酰亚胺（400卩g/ml） 37下 培养细胞并用流式细胞术（BD,美国）进行分析。2.10 统计分析数据的展现要用至少三个不同实验 SD的方法。实验结果用学生的t检验来 分析和当 P 0.05时被认为是具有统计学显著性。3 结果3.1。livin 在胃肠癌中的表达在目前的研究中 ,我们第一次验证了逆转录聚合酶链反应技术和西方吸干技 术的存在在 40胃癌中,13 癌组织和 13良性病变胃粘膜损伤。在癌组织和良性病 变胃粘膜损伤中 , 每个 mRNA 亚型不可见水平被发现后,在肿瘤组织 中,19/40（47.
16、5%）显示出 mRNA 及 livina 和 livin 蛋白质表达（Figs. 1 and 2）. livin 表达与预后变量相关 ,如组织学恶性度和淋巴结转移 ,但包括年龄、性别、阶段和肿 瘤细胞浸润程度 （表 2）。3.2。稳定转染表达 pGPU/GFP/Neo/livin 与pGPU/GFP/Neo/Control的特征我们建立了 SGC-7901 与任一 pGPU/GFP/Neo/livin 稳定转染，pGPU/GFP/Neo /Control 质粒，或空 pGPU/GFP/Neo/vector （图3）。用西方吸干技术和逆转录聚合 酶链反应技术选择每个转染的克隆并分析决定 livi
17、n mRNA, 和蛋白质表达。其他的都被选择作为扩展和另外的研究。（如图4及5）显示， livin mRNA 和蛋白质的水平在SGC-7901pGPU/GFP/Neo/livin2中转染降低了 90%以上。Livin表达抑 制在pGPU/GFP/Neo/livi n1转染和消极控制中没有被发现。所以 SGC-7901 pGPU/GFP/Neo/livi n2被用来做后续实验。3.3稳定转染中抑制细胞生长SGC-7901的增长率pGPU / GFP /Neo/ livin2均有显著的抑制转染。如图显示， SGC-7901 Pgpu/GFP尼欧/ livin2 / GFP细胞数目有显著下降转染在
18、72小时到96 小时后镀（P 0.01）而阴性对照和家长的细胞。3.4。稳定的转染容易受细胞凋亡因子刺激我们认为 SGC-7901 pGPU/GFP/Neo/livin2 转染和阴性对照细胞同细胞毒顺 铂的增长速率明显抑制，图表6中显示SGC-7901 pGPU/GFP/Neo/livin2转染细胞 数量培养后 72 小时和 96小时与消极控制和亲本细胞相比明显降低阴性对照细胞 和细胞毒药物（5 -氟尿嘧啶和顺铂）。pGPU MTT测定表明,SGC-7901 /Neo/ livin2 / GFP更敏感转染顺铂和氟尿嘧啶比消极的控制和亲本细胞（Figs. 7A, 6B）。由顺铂和 5氟尿嘧啶诱导
19、凋亡细胞数增加至约 2.5 - 3倍的 pGPU/GFP/Neo/livin2 转相比， 其控制细胞（PV0.001；图7C条。）。此外，经历了稳定转染无自发性凋亡更容易比 对照细胞（P0.05。图7C条）凋亡刺激。讨论在本研究中 ,我们表明 ,推荐的新成员 : 一个新的 IAP 家族成员，被认为是不符 合非癌胃组织的表达， 只有在胃癌患者 （47.5）的比例计算， 也表明，抑制 Livin 的表达或功能的原因自发性细胞凋亡和对 SGC - 7901 细胞生长的抑制， 使细胞更 容易凋亡刺激。据认为，活着有两个亚型， A 和 B 虽然这两个亚型在阻止肿瘤坏 死因子诱导细胞凋亡参与 - A 和抗
20、 CD95 的在体外，他们表现出一些不同的抗凋亡 的特性。活着 b 似乎是在阻断 DNA 损伤剂诱导细胞凋亡 1 3超过活着有效。一些组织中 Livin 分布研究表明，最近都活着升高亚型 A 和 B 已发现在心脏， 胎盘，肺，脾，卵巢，而活着 balone 特别是在已检测到胎儿组织和 dult 肾脏和 Livin 一单是在脑，骨骼肌和外周血淋巴细胞的检测 11-14。此外，虽然 Livin 的 表达是在一个癌细胞的细胞株和肿瘤组织中的一些品种检测 1 4- 1 8和反活着抗体 在胃癌和肺癌患者血清识别 1 9 , 2 0 ，没有数据有关亚型中 Livin 的表达在胃癌肿 瘤组织。我们的第一次研
21、究表明， 活着亚型 A 和 B 几乎都在胃癌组织（ 47 . 5 ）和 Livin 表达与一些已知的预后因素，如分级，淋巴结转移，相关的比例计算。从文献资 料表明，这两个活着亚型参与了阻止细胞凋亡，并可能给活着的过度表达与细胞 的强烈抵抗化疗诱导细胞凋亡。 胃癌一般具有高度抗癌症放化疗和中抗凋亡 21。 这些结果表明， Livin 的高表达可能对某些癌症患者和胃癌患者预后化疗的责任。与促进肿瘤细胞的凋亡抵抗可能提供一个合理干预策略在癌症治疗的基础上 发展新的特定因素干扰 22,23。由于 Livin 的表达可能有助于肿瘤细胞和肿瘤的 特异性表达及其在细胞凋亡的抗性表型可以让活着的一个有趣的肿瘤
22、治疗靶点的 具体干预措施的战略，我们选择了作为一个分子靶点的 Livin 基因。的 shRNA 技 术representiong个极其有力的工具，抑制内源性基因表达24,25作出抑制Livin 基因，并试图纠正胃癌细胞凋亡的不足。作者：沉默的shRNA功效的tageted基因的表达是不同的， 与半的生活和丰富的基因产物与靶 mRNA 作为24-27 ，以及 无障碍的关系。在这项研究中，我们观察到硅 livin1 是经常更强烈的沉默比硅 livin2 Livin 基 因。我们的研究结果还表明，沉默 Livin 基因的表达可能存在强烈的增加或几个 凋亡的代理人在场下的 SGC - 7901细胞凋亡
23、反应，抑制细胞的生长，这表明，与 美好生活的干扰导致了对凋亡刺激的敏感性。对 HeLa 细胞类似的结果报告了 Crnkovic -梅坦斯 18。总之，我们的结果表明， Livin 的表达和功能抑制自发性细胞凋亡和抑制细胞 生长的体外敏感性增强化疗药物的结果。由于在胃癌中的表达，但活着的优惠在 正常组织中，这些数据表明，针对活着途径单独或与细胞毒性药物可能在胃癌的 治疗作用。尽管他们的治疗潜力，主要技术障碍仍有待克服，才能申请成为毒品 的 shRNA 。在治疗方面，将不得不满足基因治疗的办法，如高效输送到目标细胞的免疫 反应或规避，一般的挑战。值得注意的是，在最近的研究表明，体内的 shRNA
24、可以直接应用到出生后小鼠脏器 highpressure 尾静脉注射，导致靶基因特异性抑 制28-30 。这些数据表明，一个活跃的 shRNA 通过血液的直接应用是主要可行的。英文翻译：对照版Expression of livin in gastric cancer and induction of apoptosis in SGC-7901 cells by shRNA-mediated silencing of livin geneBackground-Because of increased resistance to apoptosis in tumor cells, inhibitio
25、n of specific antiapoptotic factors may provide a rational approach for the development of novel therapeutic strategies.Livin, a novel inhibitor of apoptosis protein family, has been found to be expressed in various malignancies and is suggested to have poorly prognostic significance. However, no da
26、ta are available concerning the significance of livin in gastric cancer. In this study, we detected the expression of livin in human gastric carcinoma and investigated the apoptotic susceptibility of SGC-7901 cell by shRNAmediated silencing of the livin gene.Methods-The mRNA and protein expression o
27、f livin were analyzed by RT-PCR and western blot assay.The relationship between livin expression and clinical pathologic parameters was investigated. The small interfering RNA eukaryotic expression vector specific to livin was constructed by gene recombination, and the nucleic acid was sequenced. Th
28、en it was transfected into SGC-7901 cells by Lipofectamin 2000. RT-PCR and Western blot assay were used to validate gene-silencing efficiency of livin in SGC-7901 cells. Stable clones were obtained by G418 screening. The cell apoptosis was assessedby flow cytometry (FCM). Cell growth state and 50 %
29、inhibition concentration (IC50) of 5-FU and cisplatin was determined by MTT method.Results-The expression of livin mRNA and protein were detected in 19 of 40 gastric carcinoma cases (47.5%) and SGC-7901 cells. No expression of livin was detected in tumor adjacent tissues and benign gastric lesion. T
30、he positive correlation was found between livin expression and poor differentiation of tumors as well as lymph node metastases (P 0.05). Four small interfering RNA eukaryotic expression vector specific to livin were constructed by gene recombination. And one of them can efficiently decrease the expr
31、ession of livin, the inhibition of the gene was not less than 70% (P 0.01). The recombinated plasmids were extracted and transfected gastric cancer cells. The stable clones were obtained by G418 screening, and were amplified and cultured. When livin gene was silenced, the reproductive activity of th
32、e gastric cancer cells was significantly lower than the control groups(P 0.05). The study also showed that IC50 of 5-Fu and cisplatin on gastric cancer cells treated by shRNA was decreased and the cells were more susceptible to proapoptotic stimuli (5-Fu and cisplatin) (P 0.01).Conclusions-C Livin i
33、s overexpressed in gastric carcinoma with a relationship to tumor differentiation and lymph node metastases, which is suggested to be one of the molecular prognostic factors for some cases of gastric cancer. ShRNA can inhibit livin expression in SGC-7901 cells and induce cell apoptosis.Livin may ser
34、ve as a new target for apoptosis-inducing therapy of gastric cancer.1. IntroductionGastric cancer is one of the most common malignancies in the world. Most patients with this diseaseare diagnosed in advanced stages, and lose the chance of surgical eradication. Despite much progress in chemotherapy,t
35、he overall survival of the patients with gastric cancer in advanced stage is still poor. Resistanceof cancer cells to chemoagents may contribute to failure of the treatment. Among the reasons of drug resistance, inhibited process of cell apoptosis may play an important role.Cancer cells are often ch
36、aracterized by increased resistance to apoptosis 1, which mediates their increased resistance to various stimuli of cell apoptosis, such as DNA damage, hypoxia, nutrient-deprivation 2,3. Moreover, apoptosis resistance is considered to be a major cause of therapeutic failure for tumors in clinical pr
37、actice, since many chemo- and/or radiotherapeutic agents function through the induction of apoptotic tumor death 4.Inhibitor of apoptosis protein (IAPs) is a novel family of intracellular proteins which suppress apoptosis induced by a variety of stimuli 5,6, including viral infection, chemotherapeut
38、ic drugs, staurosporin, growth factor withdrawal, and by components of the tumor necrosis factor-a (TNF-a)/Fas apoptotic signaling pathways 7 C9. The IAPs consists of a group of structurally related proteins with antiapoptotic properties 10, and may play a substantial role in preventing tumor cell f
39、rom apoptosis, and has become the focus of research in recent years. A novel member of this family is ML-IAP/livin/KIAP/BIRC7 (in the following termed livin) which has two isoforms, livin a and livin b 11 C14.lt has been shown that over-expression of the livin can block apoptosis induced by a variet
40、y of proapoptotic stimuli 12. Interestingly, livin gene has been found to be restrictively expressed in tumor cells, but not, or to lesser amounts in most no rmal adult tissues 11 C15, an dmay con tribute to tumorige nesis by allowing malignant cell to avoid apoptotic cell death. So inhibition of li
41、vin expression may represent an interesting therapeutic strategy.ln the present study, we investigated the expression of livin in gastric cancinomas and their adjacent tissues. The relationship between livin expression and clinical pathologic parameters was analyzed. Furthermore, we explored the fea
42、sibility of shRNA in inhibiting livin gene expression and the apoptotic susceptibility of gastric cancer cell by shRNA-mediated silencing of the livin gene.2. Patients and methods2.1. Patients and tumor samplesForty samples of gastric carcinoma and 13 samples of paracancerous tissues were collected
43、from the patients who received gastrectomy (age of patients ranging from 29-77 years). Thirteen samples of benign gastric lesion (chronic superficial gastritis) were gained from the patients undergoing gastric endoscopic examination (age of patients ranging from 33-77 years). These samples were coll
44、ected from patients admitted to the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. The patients with gastric cancer were diagnosed as being in stage I to IV based on TNM classification (UICC, 2002). Tumor specimens were immediately frozen in liquid n itroge n after surgery and stored at -8
45、0 C un til use. In formed consent was obta ined from all patients.2.2. RT-PCR procedureTotal RNA (2 mg) extracted from frozen tissues was reverse transcribed in a final volume of 25 ml with 100 pmol of oligo(dT)15 and 200U M-MLV reverse transcriptase (promega, USA), according to the manufacturers gu
46、idelines.Aliquots corresponding to 2.5 ml cDNA were then amplified in PCR buffer containing 25pmol/ml each primer and 1 U Taq polymerase in a final volume of 50 ml. Each amplification was performed for 35 cycles, one cycle profile consisted of denaturationat 94 8C for 30 s, annealing at 59 8C (livin
47、 and b-actin) for 30 s and extension at 72 8C for 30 s. A sample without RNA was included in each RTCPCR as a negative control.Sequences of livin and 3-actin primers used are as follows:livina/b up stream,50-TCCACAGTGTGCAGGAGACT- 30;livina/ B downstreamijCGGCACA AAGACGATGGAC-30;b-actinupstream,50-AG
48、CGCAAGTACTCCGTGTG- 30; -acti n downstream, 50-AAGCAATGCTATCACCTCCC-30.The size of the amplified products were312/258 bp for livina/b and 501 bp for b-actin respectively.2.3. Western Blot AnalysisTissues were homogenized with lysis buffer 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 250 mM NaCl, 0.1% NP40, and 5 mM EGTA containing 50 mM sodium fluoride, 60 mM b-glycerol-phosphate, 0.5 mM sodium vanadate, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 mg/ml aprotinin, and 10 mg/ml leupeptin. The total protein concentration was determined using Coomassie Brilliant Blue. Protein samples were electrophoresed in a 10%