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1、PCR - 操作RT-qPCR步骤组织取材：各组大鼠分别于造模后6d、12d、18d断头处死，冰上取大鼠脊髓L4-6，PBS液洗净，置液氮内冻存1个小时以上，-80保存。总RNA提取准备工作1)试剂和材料：无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）(管盖与管壁都需标记样品名称)2)75乙醇、Trizol、氯仿、异丙醇预冷。3)手套：取RNase-free的物品时必须戴手套。4)擦洗取液器：DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部。5)试验前将生物安全柜UV及标本处理间UV打开照射30分钟。操作步
2、骤(所有操作均在冰上进行)1)加Trizol和样本到1.5ml EP管：组织：(剪取米粒大小)加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70长期保持。贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml。将培养皿中的培养液彻底洗干净，将1 ml Trizo直接加在培养皿中的细胞上。悬浮细胞：可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5106动物。800 g离心10 min后彻底弃上清。加入1 ml Trizol Reagent，立即用移液器抽打5 次。2)离心：12,000rpm 离心5min，弃沉淀。3)氯仿：按200ul氯仿
3、/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。4)离心：412,000g离心15min。5)取上清：吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。6)异丙醇：按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。7)离心：412,000g离心10min。8)弃上清：RNA沉于管底。9)75%乙醇（2遍）：按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。10)离心：48,000g离心5min，
4、尽量弃去上清，保证上清五残留。11)晾干：室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。12)溶解：可用10-50ul DEPC H2O（注：DEPC水的量根据提取RNA的白色沉淀的量决定），TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品65,5-10min。注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC 处理并高压。1)测O.D值定量RNA浓度。取待测RNA样品1l，滴至孔上。注：此方法提取RNAA260/A280值在1.9-2.0之间；产率估计：组织标本：（ug RNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ug RNA/106 Cell）：5-15ug。2)-
5、80度保存逆转录（mRNA到cDNA）准备试剂新鲜提取备用的总RNA：特异性PCR引物：上海生工公司第一链cDNA合成试剂盒：Thermo Scientific Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR荧光试剂盒：LightCycler? 480 SYBR Green I Master第一链cDNA合成（说明书）解冻后，混合和简单离心试剂盒的组成部分。储存在冰上。1.按照指定的顺序，将以下试剂加入一个无菌去酶的冰上预冷的EP管：（加1空白对照）2.可选择的。如果RNA模板富含GC或包括二级结构，轻轻混匀，简单离心。在PCR仪上，65C
6、孵育5分钟。迅速放入冰上骤冷5min。在PCR管较少的时候，建议在PCR仪四角分别放置一个统一规格的PCR管，以平衡热盖压力。3.按照指定的顺序加入下列成分：若样品较多，先配置mix再分装各管，轻轻混匀，简单离心，切勿涡旋震荡。5.对于oligo(dT)18 或基因特异性引物合成CDNA，在42C孵育60分钟。对于随机六聚体引物的合成，在25C孵育5分钟，随后在42C孵育60分钟。注：对于富含GC的RNA模板，反应温度可提高到45C.6.通过在70C 加热5分钟，终止反应。7.逆转录反应产品可以直接用于PCR反应，无需进行纯化。 20l的PCR反应体系可取2-5l cDNA反应产物进行扩增。2
7、-8存放1-2h；或-20C少于一周；对于更长的储存，推荐-70C。qPCR基因名片网-（http:/ 计算20 取整说明书SYB master 32.5 13 13 10上游引物 F 1 0.4 0.5 1下游引物 R 1 0.4 0.5 1PCR级水13.5 5.4 5 3cDNA模板 2 0.8 1 5合计50 20 20 201.计算孔数+2。（每样本分入3复孔）。对照不加模板，而加水。2.配模板混合物：根据RNA定量结果，稀释到1。3.配引物总量混合物（0.5 EP）。使用PCR引物的最终浓度0.2到1m。推荐起始浓度为0.5 m。4.配SYBR混合物（1.5 EP）。5.按20ul/孔,分装至96孔板。6.依次加，模板，引物，荧光。96孔板布局上机。PCR程序设定，反应条件如下：Experimental Protocol样品编辑与结果计算：以-actin作为内参照，检测每个反应管内荧光强度达到设定域值时所经历的循环数(即Ct值)，mRNA的相对表达水平用2-CT进行计算。mRNA相对表达量=2-CT x 100；Ct=目标基因CT值一内参(B-actin)CT值。