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1、1,2,工业常常被责为使地球变暖的“温室”气体之源,但是农业也向大气中排放“温室”气体。,3,中文名称： 甲烷 英文名称： methane;CH4 定义： 一种主要由稻田和湿地释放出来的温室气体。,温室气体甲烷,甲烷分子的结构图,甲烷在自然界分布很广，是天然气、沼气、油田气及煤矿坑道气的主要成分。它可用作燃料及制造氢气、碳黑、一氧化碳、乙炔、氢氰酸及甲醛等物质的原料。,4,虽然大气中甲烷的含量仅为二氧化碳的1/ 27, 但每摩尔甲烷引起气候变化的作用是每摩尔二氧化碳的2030倍。因此, 减少甲烷排放要比减少等量的二氧化碳排放, 对减少温室效应的贡献要大的多。,5,甲烷是一种重要的温室气体, 近
2、200 年来其在大气中的含量以每年1%的速度急剧增加,主要是由于甲烷排放源的增加和甲烷汇的减少。80% 90% 的甲烷来源于生物活动, 而甲烷的唯一生物汇为土壤里甲烷氧化细菌的氧化作用, 大约占大气甲烷汇的10%。,6,甲烷氧化细菌,根据形态差异、休眠阶段类型、胞质内膜精细结构和一些生理特征的不同, 甲烷氧化菌分为： 甲基单胞菌属( Methylomonas ) 甲基细菌属( Methylobacter) 甲基球菌属( Methylococcus ) 甲基孢囊菌属( Methylocyt is) 甲基弯曲菌属( Methylosinus ) 甲基微菌属( Methy lomicrobium )
3、,7,根据形态、GC%、代谢途径、膜结构、主要磷脂酸成分等系列特征, 可将甲烷氧化菌分为二种: 型和型,型甲烷氧化菌包括Methylomonas、Methy lobacter 、Methylococcus、Methy lomicrobium、Methylocadum、Methy losp haera 等6 属, 它们利用5-磷酸核酮糖途径( RuMP Pathway) 同化甲醛, 主要含16-C 脂肪酸, 胞内膜成束分布。 而Methylosinus 和Methylocystis 则属于人们所熟知的型甲烷氧化菌。 型菌同化甲醛的途径是丝氨酸途径( Serine pathway ) , 其占优势
4、脂肪酸为18-C 脂肪酸, 胞内膜分布于细胞壁的周围。,8,甲烷氧化细菌,甲烷同化细菌( methane-assimilat ing bacteria MAB),甲烷共氧化细菌( autot rophic ammonia-oxidizing bacteria AAOB),甲烷氧化菌是甲基氧化菌的一个分支, 其独特之处在于其能利用甲烷作为唯一的碳源和能源。几乎所有的甲烷氧化菌都是专性甲烷氧化菌。,9,微生物利用甲烷的关键酶是甲烷单加氧酶( MethaneMonooxygenase,MMO) 。 第一步由MMO将甲烷活化生成甲醇, 甲醇进一步氧化为甲醛, 甲醛再同化为细胞生物量或通过甲酸氧化为CO
5、2, 然后经过一系列的脱氢反应生成CO2 重新回到大气的碳库中, 即甲醇甲醛甲酸盐CO2。 甲烷氧化菌中MMO 以两种形式存在, 一种是以可溶性形式存在于细胞质中, 称为可溶性甲烷单加氧酶( sMMO) ; 另一种是以颗粒形式存在于细胞膜上, 称为颗粒性甲烷单加氧酶( pMMO)。,10,基于sMMO 基因建立的PCR 技术在对铜离子缺乏环境中的甲烷氧化菌研究中很有用。 在低铜离子浓度( 低于1 umolL- 1) 的条件下，sMMO 基因表达并产生活性。 然而更好的功能基因探针应基于pMMO 基因, 设计出针对pmo基因的PCR 引物, 成功用于对从许多环境样品中分离的甲烷氧化菌DNA 的扩
6、增。,11,几乎所有的甲烷氧化菌都能合成pMMO, pMMO 只有在铜离子浓度超0.851umolg- 1细胞( 干重) 时才表现活性。 铜离子的含量对pMMO/ sMMO 的平衡具有重要意义。 无论培养基是否含有铜离子, 增加铜离子浓度可导致pMMO 活性增加; 增加铜离子浓度还可以导致合成更多的胞内膜、与pMMO 相关的膜蛋白的出现、生长量的增加和sMMO 活性的减少。 拥有pMMO 的甲烷氧化菌比含有sMMO 的甲烷氧化菌具有更高的生长速率和更大的甲烷亲和力, 因此有人认为某些甲烷氧化菌合成sMMO 只是作为在许多环境条件下铜离子限制pMMO 的活性而由细菌产生的一种生存机制。,12,甲
7、烷氧化途径的第二个酶是甲醇脱氢酶 ( methanol dehy drog enase, MDH) 。所有 革兰氏阴性甲基氧化菌都有编码甲醇脱氢 酶大亚基的mxaF基因, 其序列高度保守, 因 此MDH 可以作为这些生物在环境中存在的很好指示剂。 型和型甲烷氧化菌在环境中的分布并不相同:型甲烷氧化菌在允许氧化菌快速生长的环境中占优势, 而型菌在贫营养环境下能存活得更好，从而有较广泛的分布。,13,实验结论,设计微模型,样品前处理,甲烷菌种群假说,引物分析,图形对应分析,微模型甲烷菌种群分析,样品操作,14,设计微模型,模拟自然状态下水稻田里甲烷菌种群的生活状态，这个实验选用养分充足的湿润土壤，
8、人工创造氧隔分界 设置16组相同的微模型组，分阶段，分析影响种群结构的环境土壤参数,15,样品前处理,16组样品分8次制备样品，放置在25度黑暗环境中，每隔3天，拿出其中2个微模型，对其土壤进行拌匀，放液氮中保存，做好进一步分析的准备。,16,TRFLP:末端限制性片段长度多态性技术,是以荧光标记引物PCR为基础,根据末端限制性片段长度区分出微生物群体组成的一种微生物群体图谱法。 末端限制性片段长度多态性技术TRFLP具有快速、重复性高、灵敏、高通量等优点。 虽然该技术已经应用了十几年,但是DNA 提取、PCR 扩增、酶切以及数据分析等诸多过程中的技术细节如果不注意,有可能引起TRFLP分析误
9、差。,17,TRFLP原理,TRFLP集RFLP、PCR 和核酸电泳技术于一体。,该方法依据微生物的比较基因组学信息,选取一段具有系统进化标记特征的DNA序列为目的分析序列,并据此设计出理想引物,用荧光物质标记出1个或2个引物的5端(2个引物同时标记时,要用不同的荧光物质标记)。扩增后的PCR产物用四碱基限制性内切酶进行消化,荧光标记末端片段可被测序仪识别,得到不同的末端片段峰,每一个峰就可至少代表一种类型的微生物,通常用系统分类操作单元(OTU)来表示。故根据片段峰的大小和数量可以检测和分析环境样品中微生物的末端限制性片段图谱,进而可分析出微生物群体的组成和动态变化等生态信息。,18,TRF
10、LP分析的主要步骤,1.DNA 样品的准备 2.标记性DNA序列区段的选取 3.DNA的荧光标记引物PCR扩增 4.四碱基限制性内切酶的选取 5.酶切图谱的分析 TRFLP数据的分析 克隆文库的应用,19,1.DNA 样品的准备,TRFLP分析结果依DNA 提取质量、方法等条件不同而产生差异,进而影响微生物群体相对含量的正确估计。 综合各种因素考虑,建议在进行样品DNA 提取时,要重复采样，避免取样产生的误差,并将样品均匀混合后采用同一方法提取DNA 且设置2个或者更多的重复,并混合DNA样品进行下一步的分析,以确保TRFLP 技术对样品微生物分析的准确性和真实性。 样品DNA 由于其组分的复
11、杂性,为保证后续分析质量,最好用试剂盒或者凝胶电泳切胶等措施进一步纯化,以去除多糖、有机酸等对后续PCR 分析的影响。,20,2.标记性DNA序列区段的选取,高质量代表性DNA 获取后,选取具有标记性 DNA 序列区段对TRFLP 分析尤其重要。 多年来的研究表明,对于细菌来说,16S rRNA 基因区段因其高度的保守性已经成为备受青睐的系统发育分析生物标记;但由于过度保守,使得某些微生物在种甚至属水平上难以准确区分。,在进行细菌群体图谱的TRFLP 分析时,应根据样品特点选择出尽可能充分区分开微生物群体的特征区段。,21,3.DNA的荧光标记引物PCR扩增,选择好标记性目的DNA 片段后,需
12、选择恰当引物并优化PCR 条件。因为TRFLP 是基于PCR的微生物群体图谱分析法。由PCR 产生的诸如引物错配和退火、模板浓度、循环数、基因组大小以及拷贝数等一系列因素产生的偏差均会影响TRFLP的分析。 除PCR 条件外, PCR 产物中残余酶活对TRFLP 结果的影响也不容忽视。 PCR 产物浓度也是一个重要因素。作为TRFLP 反应的DNA 模板, PCR 产物的浓度降低时,微生物群体的T2RFL P 图谱的复合性与清晰度均下降。,22,4.四碱基限制性内切酶的选取,确定好PCR 产物质量浓度后,下一步就是产物 的限制性内切酶消化反应了。 四碱基限制性内切酶的选择原则:能够明显区分出不
13、同的微生物,即产生的末端片段峰大小区别明显,尽量避免只差一个碱基的情况;同时,消化后产生的单峰具有特异性,产生的杂峰尽可能少。 总之,限制性内切酶的选择对TRFLP分析特别重要,为确保选择到理想的酶,应该用纯培养物检验后再进行样品分析。,23,5.酶切图谱的分析,选择好限制性内切酶后,根据说明对样品或者分离菌的纯化PCR 产物进行酶切消化。值得注意的是不同的酶所需的消化温度不同。研究表明,不完全消化会对TRFLP结果产生负面影响,而酶浓度过高还会产生过多的假片段峰。 测序仪有凝胶电泳和毛细管电泳2种。 研究证明，凝胶电泳产生的TRFLP图谱存在胶与胶之间的差异,重复性要差于毛细管电泳。因而分析
14、时尽量采用毛细管电泳设备,其不仅操作方便,而且实验结果重复性好。,24,TRFLP数据的分析,测序仪分析后,会依据末端荧光标记片段的大小产生不同的片段峰。TRFLP分析的突出优点是其结果为数据化的。这时, 需要用软件GeneMapper V3. 7来分析得到的TRFLP结果。 根据这些数据信息不但可以准确判断出末端片段峰的大小,且可以根据峰面积以及峰高对各种微生物进行半定量分析。,25,克隆文库的应用,T-RFLP 能够快速分析出样品中微生物的群体信息 , 必须结合克隆文库以及分菌的序列信息才能鉴定各个片段峰代表具体微生物信息。,26,图形对应分析,图中可以看出，DNA和mRNA有很大区别，说
15、明114bp 241bp 531bp 208bp 46bp 278bp 226bp是主要的活性甲烷菌，114bp 241bp 531bp的活性甲烷菌不存在休眠状态。可以看出样品都是成对分布的，偶有1个是孤立的，说明那次实验产生了大的误差，也就是说一组样品必须成对。另外可以看出白三角形跟白圈整体形状十分地接近，这说明试验中，液氮冻存并未造成mRNA的分解，那2种实心三角形和实心圈也一样。,27,该图反映种群结构是随时间改变的，a是类型I和II甲烷菌特点，在第二阶段中，类型II甲烷菌的含量增加。B是类型Ia和Ib甲烷菌在第一阶段具有高活性，而在后一阶段，只有类型II具有高活性。这说明其中环境参数影
16、响了种群结构，正向引物受氨氮跟硫酸盐影响，他们的减少跟a图像联系。而对来说，dna反向引物不受环境参数影响，mrna反向引物受到硫酸盐的影响，而正向引物却不会。,28,小结,对应分析是多维图示分析技术的一种，是通过进行主成分分析来描述两个或多个分类变量各水平间相关性的分析方法。 对应分析的结果主要采用反映变量间相互关系的对应分析图来表示，该图形中每一个散点代表某个变量的一个水平，有较密切关系的水平其散点将紧密地靠近在一起，从而在结果的解释上非常直观。 对应分析虽然可以揭示变量间的联系，但它不能说出两个变量之间存在的联系“是否显著”，所以只是一种“探索”性的分析,29,引物分析,在正向引物T-P
17、CR,RT-PCR中，非常完整清楚地显示了类型I和II甲烷菌的演替过程。特别是类型I，在类型II甲烷菌增加过程中也有显示. 在反向引物T-PCR中，能显示甲烷氧化菌演替过程，但这过程受到氨氧化细菌影响，因为反向引物在该细菌内也能起作用 在反向引物RT-PCR中，不能正常显示 另外，在类型Ib甲烷菌中，2种引物均能在结合同一起始位点 从中可以知道通过一种引物是很难分析种群种类的，这就是这个实验采取多个引物的原因,30,微模型甲烷菌种群分析,在dna水平上，我们观察到，在25天后的微模型中，类型II甲烷菌相对含量增加，而类型Ia甲烷菌随之减少，可能这类甲烷菌还需要环境中的其他营养物质。有趣的是，类型Ib甲烷菌标记片段含量很高，在活性甲烷种群中是最主要的一个种类。,31,甲烷菌种群假说,有些甲烷菌在干旱环境里能形成抗旱性包囊，有报道称最多的能存活170年。也就是说活性跟休眠的转换取决于环境状况，但到目前，这还是个假说，而这次演替实验完全支持这个假说。,32,实验结论,这个甲烷菌演替实验显示，甲烷菌种群内总有几个种类甲烷菌在氧化甲烷，在各个相等时间段中，总的甲烷菌种群氧化掉的甲烷量基本上相同。因此，我们推测这个活性甲烷子集群氧化甲烷效率保持动态平衡。,33,谢谢,