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1、1,第七章 色谱,色谱部分,2,第一节 色谱法概述,3,7.1.1 色谱法的特点、分类和作用,俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置： 色谱原型装置，如图。,1、概述,色谱法(chromatography)：以试样组分 在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、 离子交换或其他亲和作用的差异为依据而 建立起来的各种分离分析方法称色谱法。,4,有关名词：,固定相（stationary phase）:色谱法中，填入柱管 内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相。如离子交换树脂法中的树脂相。 流动相(mobile phase):携带样品流过固定相的流体（一般是气体或液体）称为流动相。 色谱柱(chro
2、matography column):装有固定相的管子称为色谱柱。,5,色谱法的共同特点：,任何色谱法都存在两个相，即流动相和固定 相；流动 相可以是气体或液体，固定相为固体或涂渍在固体表 面的高沸点液体； 流动相对固定相作相对运动，它携带样品通过固定相； 被分离样品中各组分与色谱两相间具有不同的作用力， 这种作用力一般表现为吸附力或溶解能力，正是这种 作用力的差异导致通过各组分通过固定相时达到彼此 分离。,6,2、色谱法分类,（1）气相色谱：流动相为气体（称为载气）。 按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱,（2）液相色谱：流动相为液体（也称为
3、淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。 (3)其他色谱方法：薄层色谱和纸色谱、凝胶色谱法、 高效毛细管电泳法等。,7,第二节 气相色谱法(GC) Gas Chromatography,8,（1）分离效率高： 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。 （2） 灵敏度高： 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量. （3） 分析速度快： 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 （4） 应用范围广： 适用于沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。 不足之处： 不适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质的分析。 被分离组分的定性较为困难。,1、气
4、相色谱法的特点,7.2.1 概述,9,2、气相色谱分离过程,当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附。 随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附， 挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附。 随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。,10,3、分配系数 K,组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：,11,分配系数 K的讨论,一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢； 试样一定时，K主
5、要取决于固定相性质； 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果； 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础； 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。,12,7.2.2 气相色谱仪,13,HP5890色谱仪,14,福立GC9790色谱仪,15,气相色谱仪通常由五部分组成： 载气系统：气源、气体净化器、供气控 制阀门和仪表。 进样系统：进样器、汽化室。 分离系统：色谱柱、控温柱箱。 检测系统：检测器、检测室。 记录系统：放大器、记录仪、 色谱工作站。,16,17,气路系统,载气:气相色谱中常用的载气有氢气，氮 气，氦气和氩气。 气路结构:主要有两种气路形
6、式 单柱单气路，适用于恒温分析 双柱双气路，适用于程序升温，并能补偿固定液的流失使其基线稳定。 净化器:主要用来提高载气纯度。 稳压恒流装置:稳定载气流速。,18,进样系统,Dissolved in an organic solvent. Injected into the carrier gas flow by syringe or valve.,包括进样装置和气化室,19,分离系统,气相色谱的分离系统是色谱柱，常 用的色谱柱有填充柱和毛细管柱两 种：填充柱是以固体吸附剂或涂渍 了固定液的载体颗粒填充到柱管内形成的柱子；毛细管柱内没有填充颗粒，是将固定相涂渍或者以化学键合方式附着到管内壁上。
7、由于混合物各组分的分离在这里完成，所以它是色谱仪中最重要的部件之一。,20,气液色谱填充柱的固定相通常由一种惰性多孔固体（称为担 体）及在其表面上涂渍一层较薄的高沸点有机物（称为固定 液）液膜构成。,1、担体,提供一个大的惰性表面，以便使涂渍的固定液膜有足够的容量。担体应具有化学稳定性好、热稳定性好、有一定的机械强度、合适的颗粒及均匀的粒径。常用的有硅藻土类。,2、固定液,对色谱分离起着决定性作用。应具有化学稳定性、热稳定性好、蒸汽压低、对分析样品有适合的溶解能力，并有高的选择性。固定液在操作温度下是一种液体，柱温不能超过固定液的最高使用温度，否则会使它大量随载气流失。,21,温控系统,温控系
8、统是用来设定，控制，测量色谱柱炉、气化室、检测室三处的温度。,气化室的温度应使试样瞬时气化而又不分解。在一般情况下，气化室的温度一般应比试样中最高组分沸点高20-30 C左右，比柱温高10 50C。,22,热导池检测器 thermal conductivity detector, TCD 氢火焰离子化检测器 flame ionization detector, FID 电子捕获检测器 electron-capture detector, ECD 热离子化检测器 thermionic detector, TID 火焰光度检测器 flame photometric detector, FPD,检测
9、器,23,热导池检测器 TCD,工作原理：被分离的组分具有与 载气不同的热导系数，当检测器 的金属丝被加热并温度达到恒定 后，通过热导池的载气组成若发 生变化就会带走与载气不同的热量， 从而引起热敏元件阻值的变化。,24,氢火焰离子化检测器 FID,工作原理：以氢气和空气的混合物燃烧火焰为能源，将进入检测器的有机物离子化，生成许多离子对，带电离子被安装在检测器上的电极吸引产生微弱的电流，经放大被记录仪记录。对含碳物质检测灵敏度高，而对不含碳物质无响应。,25,7.2.3 色谱理论基础,1、气相色谱流出曲线,流动相带着组分通过色谱柱到达监测器时，由记录仪 得到的信号时间曲线。,26,基线：无试样
10、通过检测器时，检测到的信 号即为基线。 基线漂移：基线随时间定向缓慢地变化。,基线,基线漂移,2、色谱术语,27,峰高 h （peak hight ）：峰的顶点到峰底之间的垂直距离。 峰面积A （peak area） ：峰与峰底之间的面积。,28,保留值,A、时间表示的保留值 保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间 死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间。 调整保留时间（tR ）：tR= tRtM,29,B、用体积表示的保留值,保留体积（VR）：VR = tRF0 （ F0为色谱柱出口处的载气流量， 单位：m L / min。） 死体积（VM）： VM
11、= tM F0 调整保留体积（VR）： V R = VR VM,30,组分2与组分1调整保留值之比： r21 = tR2 / tR1= VR2 / V R1 相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。,C. 相对保留值r21,31,色谱分析的实验依据： 、根据色谱峰的位置（保留时间）可以进行定性分析。 2、根据色谱峰的面积或峰高可以进行定量分析。 3、根据色谱峰的展宽程度，可以对某物质在实验条件下的分离特性进行评价。,32,3、色谱分析的基本理论,(1)热力学理论：塔板理论平衡理论 把色谱分离的过程模拟为精馏塔的分离过程，把色谱柱比作一个精
12、馏塔。 （2）动力学理论：速率理论,33,4、色谱操作条件的选择,(1)、 固定相的选择 气液色谱，应根据“相似相溶”的原则 分离非极性组分时，通常选用非极性固定相。各组分按沸点顺序出峰，低沸点组分先出峰。 分离极性组分时，一般选用极性固定液。各组分按极性大小顺序流出色谱柱，极性小的先出峰。 分离非极性和极性的（或易被极化的）混合物，一般选用极性固定液。此时，非极性组分先出峰，极性的（或易被极化的）组分后出峰。 醇、胺、水等强极性和能形成氢键的化合物的分离，通常选择极性或氢键性的固定液。 组成复杂、较难分离的试样，通常使用特殊固定液，或混合固定相。,34,(2)、柱长和柱内径的选择 增加柱长对
13、提高分离度有利，但组分的保留时间tR ，且柱阻力，不便操作。 柱长的选用原则是在能满足分离目的的前提下，尽可能选用较短的柱，有利于缩短分析时间。 填充色谱柱的柱长通常为13米，内径34厘米。,35,(3)、柱温的确定,首先应使柱温控制在固定液的最高使用温度（超过该温度固定液易流失）和最低使用温度（低于此温度固定液以固体形式存在）范围之内。 柱温升高，分离度下降，色谱峰变窄变高。柱温，被测组分的挥发度，即被测组分在气相中的浓度，K，tR，低沸点组份峰易产生重叠。 柱温，分离度，分析时间。对于难分离物质对，降低柱温虽然可在一定程度内使分离得到改善，但是不可能使之完全分离，这是由于两组分的相对保留值
14、增大的同时，两组分的峰宽也在增加，当后者的增加速度大于前者时，两峰的交叠更为严重。 柱温一般选择在接近或略低于组分平均沸点时的温度。 组分复杂，沸程宽的试样，采用程序升温。,36,程序升温,37,(1)、色谱定性鉴定方法,A.利用纯物质定性的方法 利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。 利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。 B.利用文献保留值定性 相对保留值r21：相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据
15、，可以用来进行定性鉴定。,5、色谱定性、定量分析方法,38,C.与其他分析仪器联用的定性方法,小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS） 色谱-红外光谱仪联用仪； 组分的结构鉴定,39,A.外标法,将待测组分的纯物质配成不同浓度的标准溶液，使浓度与待测组分接近，然后取固定量的上述溶液进行色谱分析，得到各标准样品的对应色谱图。,图 某组分的标准物质的色谱图,(2)、 色谱定量分析方法,40,再在同样的条件下（同样的色谱操作条件和进同样的体积），分析待测试样，得到色谱图。,图 某样品的色谱图,外标法（续）,41,以标准样品的色谱峰面积作图，得到一条标 准曲线，再在标准曲线上根据待测样品的峰面积查出待测
16、组分的浓度。,图 标准（工作）曲线图,外标法（续）,外标法的特点： 操作简单，因而适用于工厂的控制分析和自动分析，但结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。,42,B. 内标法,内标物要满足以下要求： （1）试样中不含有该物质； （2）与被测组分性质比较接近； （3）不与试样发生化学反应； （4）出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。 试样配制：准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物mS 计算式：,43,内标法特点,内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变 动对定量结果的影响不大。 2. 每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。 3. 若将内标法中
17、的试样取样量和内标物加入量固定，则：,44,第三节 高效液相色谱（HPLC）,45,液相色谱仪,46,7.3.1 高效液相色谱法的特点,特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,47,高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）,48,一、HPLC与GC差别,1分析对象的区别 GC：适于能气化、热
18、稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20%。 HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%。,49,2流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控
19、作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,50,5.3.2 流程及主要部件,1.流程,51,2.主要部件,(1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150350105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,52,(2) 梯度淋洗装置,外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯
20、度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,53,(3) 进样装置,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的 六通阀进样装置，其结构如图所示：,54,(4) 高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,55,(5) 高效液相色谱检测器,紫外光度检测器（UV）：最小检测量10-9gmL-1， 对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。最常用的检测器。,56,HPLC的特点和实际应用,1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极 复杂 体系中的痕量组分。 正相色谱分离有机溶剂中的物
21、质 反相色谱分离水溶液中的物质-生化物质。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨 基酸、常见阴阳离子等） 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 合物。,57,1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp10m） 首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相甲醇， 约1ml/min 3. 柱温的选择：选室温250C左右,HPLC法中分离条件的选择,58,2. 固定相及分离柱,气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色
22、谱，其选用原则与气相色谱一样。 选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。 选择短柱、细内径提高分析速度； 研制高效柱填料是一活跃领域。,59,3. 流动相及流动相的极性,（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。 （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,60,
23、选择流动相时应注意的几个问题：,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂 质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,61,第四节 凝胶渗透色谱(GPC) Gel Permeation Chromatography,62,一种新型的液体色谱，1964年，J. C. Moore首先研究成功。 不仅可用于小分子物质的分离与鉴定，而且可作为用来分析
24、化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。 现阶段，已经成为最为重要的测定聚合物的分子量与分子量分布的方法。,介绍,63,GPC以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、 具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。 如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、 聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；聚合物在分离柱上按 分子流体力学体积大小被分离开.,64,体积大的分子先被淋洗出来 体积小的分子后被淋洗出来,65,(1) 测定原理,淋出体积：自试样进入色谱柱到淋洗出来，所接收到的淋出液的体积，称为该试样的淋出体积Ve。 当仪器与实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分子量有关，分子量越大，其淋出体积越小。,66,(2)
25、 体积排除机理,溶质分子的体积越小, 其淋出体积越大. 这种解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相中的分配效应, 其淋出体积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸决定, 分离完全是由于体积排除效应所致, 所以GPC又被称为体积排除色谱(SEC， Size Exclusion Chromatography),67,GPC曲线,淋出体积代表了分子量的大小-M； 浓度响应代表了含量-W(M) GPC曲线就是聚合物的分子量分布曲线,68,(3) 级分分子量的确定,直接法：在测定淋出液浓度的同时测定其粘度或光散射。 间接法：采用一组分子量不等、单分散的样品（标样），分别测定其淋出体积与分
26、子量，从而标定色谱柱分离的分子量与其淋出体积间的关系-分子量-淋出体积标定曲线。,69,分子量-淋出体积标定曲线,A,B,C,D,V0,logMa,logMb,一般而言，分子量与淋出体积间具有如下关系:,当分子量大于Ma时, 曲线如何?,当分子量小于Mb时, 曲线如何?,色谱柱的分离范围: MbMa,M1,M2,M3,M4,M5,V1,V2,V3,V4,V5,70,普适校正原理 由于GPC对聚合物的分离是基于分子流体力学体积，即对于相同的分子流体力学体积，在同一个保留时间流出，即流体力学体积相同。 两种柔性链的流体力学体积相同： 1M1=2M2 k1M11+1=k1M22+1 两边取对数：lg
27、k1+(1+1)lgM1=lgk2+(2+1)lgM2 即如果已知标准样和被测高聚物的k、值，就可以由已知相对分子质量的标准样品M1标定待测样品的相对分子质量M2。,71,实验部分,GPC仪的组成： 泵系统、（自动）进样系统、凝胶色谱柱、检测系统和数据采集与处理系统。,72,泵系统： 包括一个溶剂储存器、一套脱气装置和一个高压泵。它的工作是使流动相（溶剂）以恒定的流速流入色谱柱。泵的工作状况好坏直接影响着最终数据的准确性。越是精密的仪器，要求泵的工作状态越稳定。要求流量的误差应该低于0.01mL/min。,73,色谱柱： GPC仪分离的核心部件。是在一根不锈钢空心 细管中加入孔径不同的微粒作为
28、填料。 填料（根据所使用的溶剂选择填料，对填料最基本的要求是填料不能被溶剂溶解）：交联聚苯乙烯凝胶（适用于有机溶剂，可耐高温）、交联聚乙酸乙烯酯凝胶（最高100，适用于乙醇、丙酮一类极性溶剂）多孔硅球（适用于水和有机溶剂）、多孔玻璃、多孔氧化铝（适用于水和有机溶剂） 柱子：玻璃、不锈钢,74,检测系统： 通用型检测器：适用于所有高聚物和有机化合 物的检测。有示差折光仪检测器、紫外吸收检测器、粘度检测器。 示差折光仪检测器：溶剂的折光指数与被测样品的折光指数有尽可能大的区别 紫外吸收检测器：在溶质的特征吸波长附近溶剂没有强烈的吸收。 选择型检测器：适用于对该检测器有特殊响应的高聚物和有机化合物。
29、有紫外、红外、荧光、电导检测器等。,75,实验部分,影响因素： 色谱柱、溶剂的选择,76,色谱柱： 每根色谱柱都有一定的相对分子质量分离范围 和渗透极限，色谱柱有使用的上限和下限。色谱柱的使 用上限是当聚合物最小的分子的尺寸比色谱柱中最大的凝胶的尺寸还大，这时高聚物进入不了凝胶颗粒孔径，全部从凝胶颗粒外部流过，这就没有达到分离不同相对分子质量的高聚物的目的。而且还有堵塞凝胶孔的可能，影响色谱柱的分离效果，降低其使用寿命。色谱柱的使用下限就是当聚合物中最大尺寸的分子链比凝胶孔的最小孔径还要小，这时也没有达到分离不同相对分子质量的目的。所以在使用凝胶色谱仪测定相对分子质量时，必须首先选择好与聚合物
30、相对分子质量范围相配的色谱柱。,77,实验部分,溶剂的选择： 能溶解多种聚合物 不能腐蚀仪器部件 与检测器相匹配,78,实验部分,色谱柱对于多分散聚合物的分离作用是基于体积排除机理，与分子量没有直接联系。 把激光光散射与凝胶色谱仪联用，在得到浓度谱图的同时，还可得到散射光强对淋出体积的谱图，从而计算出分子量分布曲线和整个试样的各种平均分子量。,79,实验部分,激光光散射实验中必须对样品严格除尘，溶液中的灰尘会产生强烈的光散射，严重干扰聚合物溶液光散射的测量。溶液除尘是光散射成败的关键。首先是溶剂除尘，配置测试样品的溶剂应进行精馏，并经过0.2m超滤膜过滤后方可使用。配好的溶液也要用0.2m的超滤膜过滤。另外，测试中所用的器械，如：注射器等，使用前要用洗液浸泡，清水强力冲洗。,