1.液相色谱基础理论PPT演示课件.pptx

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1、液相色谱原理应用,尚 飞,1,液相色谱基础知识部分 液相色谱简介 液相色谱理论基础,2,高效液相色谱简介,3,色谱的发明人 俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献,4,经典液相色谱,Review Stop 叶绿素 中的有 色物质,石油醚 淋洗剂 叶绿素 碳酸钙 颗粒,5,色谱法简介 色谱法（Chromatography）溯源 俄国科学家1903年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离 植物色素的新方法并见诸于俄文的文献 1906年正式命名（见诸文献） 色谱法；Chromatography 50年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱 高效液相色谱法的广泛应用始

2、于70年代,6,什么是高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段： 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器 在技术，理论及应用上处于迅速发展阶段,7,应用领域,食品、饮料,化,工,生物技术、医药,环,境,应用领域 ,8,HPLC技术的发展趋势 高速化、高效化 高精度的高压泵、能走梯度洗脱； 高灵敏度的检测器、紫外/可见光检测器,二极管阵列检测器（DAD） ，荧光检测器，电喷雾检测器（CAD）以及示差、蒸发光散射检测 器等。 微粒硅胶为LC发

3、展奠定了基础，现在的填料粒度大多为10m、5 m 甚至3 m 、亚2 m ，填料的微粒化产生了快速柱，微粒柱提高 了分离效率和分析速度。 键合相填料的出现拓宽了LC在多领域的实用能力。 微径柱，毛细管柱，Nano柱提高灵敏度和分离效率 特种柱，专用柱增强了色谱分离的选择性,9,HPLC技术的发展趋势 自动化、智能化 由色谱工作站单点控制泵、自动进样器、检测器的操作程序并作色谱 数据处理和光谱信息处理，从而实现24小时无人操作。 二极管阵列检测器的作用可在色谱分析的同时作光谱确认 HPLC与质谱仪的联用技术,10,液相色谱系统：总体设计, ,泵（含脱气机） 自动进样器 色谱柱（放于柱温箱中） 检

4、测器 系统控制软件（电脑）,控制软件,泵,自动进样器,色谱柱,检测器,11,Thermo UltiMate 3000仪器配置 梯度泵 独特的柱温箱可放置两个柱 切换阀,脱气机和溶剂架 带温控选项的自动 进样器 可变波长或二极管矩阵 紫外可见光检测器,12,高效液相色谱基础理论,13,色谱分离过程,流动相,色谱柱,流动相流动方向 色谱分离过程 固定相,固定相根据不同的相互作用原理和强度保留分析物 由于不同化合物与固定相和流动相之间的相互作用强度和机理不同，所以当 化合物流经色谱柱时就会被分分开。,14,363 1 - 5,573 2 - 6,8,863 3 -,8,4 - 12,930,液相色谱

5、图简介,600,140,0,1 - Parabene_Summit_0710 2 - Parabene_Summit_0710 mAU,UV_VIS_ Pump_Press bar,Parabene isocratic 70B Sum Parabene isocratic 70B Sum 保留时间,检测器信号,峰高 压力信号及 波动,100,500 400 300 200,130,0 120,0 110,0,峰面积,-50,90,0,100,0,min,1,2,Methanol: 70,0 % Flow: 0,50 ml/min,%D: 0,0 % %C: 0,0 %,基线,0,0,1,0,2

6、,0,3,0,4,0,5,0,6,0,7,0,8,0,9,0,10,0,11,0,12,0,13,0,14,0,15,0,15,色谱图：即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。,15,基础理论：术语介绍 色谱峰 Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线 峰底 Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线 峰高 Peak Height 峰最大值到峰底的距离 峰宽 Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半（高）峰宽 Peak Width at Half Height 通过峰高的中点作平

7、行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距 离,16,基础理论：术语介绍 峰面积 Peak Area 峰与峰底之间的面积,又称响应值 标准偏差； Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半 拖尾峰 Tailing Peak 后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰 Leading Peak 前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰 Ghost Peak 并非由试样所产生的峰；亦称假峰,17,基础理论：术语介绍 基线Baseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线 基线飘移 Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢变化 基线噪声；N Baseline Noise

8、 由各种因素所引起的基线波动 谱带扩展 Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中 谱带宽度增加的现象,18,基础理论：术语介绍 死时间，t0 Dead time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间 保留时间，tR Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间 调整保留时间，tR Adjust retention time 保留时间减去死时间 死体积，V0 Dead volume 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 保留体积，VR Retention volume 组分从进样到出现

9、峰最大值所需的流动相体积 调整保留体积，VR Adjust retention volume 保留体积减去死体积,19,不对称因子计算示意图,峰高,EP/USP标准： AIA标准：,LW,RW,LW10% LW5%,RW10% RW5%,A= 0.951.05：正常峰 A 1.05：拖尾峰,20,色谱的分离度,色谱峰的完全分离是每一个色谱方法的目标。,21,分离度方程, k 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱 是选择因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素 N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度,22,基础理论：塔板理论,固,流,动,塔板模型假设色谱柱是由大量分离

10、 层构成的，这些分离层称之为理论 塔板 这些塔板实际是不存在的，他们只 是一种假设用来帮助描述色谱柱里 所发生的一切,定,相,相,在这些塔板里面，固定相和流动相 之间存在着一种平衡,分析物在这种平衡里面存在着一种 平衡系数K，定义为： K = C固定相 / C流动相 随着K的增加，分析物从色谱柱中 的流出时间就越长，即分析物的在 色谱柱内的保留时间越长,23,concen,ntration,塔板理论数与柱效的关系 理论塔板数用来衡量色谱柱质量好坏 理论塔板数(N)：理论塔板数越高，柱效越高 或者 理论塔板高度 (H)：理论塔板高度越大，柱效越低 高柱效色谱柱比低柱效色谱柱在同一保留时间峰更窄

11、理论塔板数越高，柱效越高,wh wh,色谱柱长,time (length),L H,N =,理论塔板数,理论塔板高度,24,25,t,=,0 2 4 6 8 10, 常用k值范围,改变 k 值的方法 调节流动相的极性（比例）、pH 、,容量因子对分离度的影响, t0,t t,R,=,k=,固定相 流动相,t R - t0 t0 k值小 组分流出快，接,25,tR,近死时间 分离度差 k值大 分离度好 k值更大 保留时间更长 峰会展宽，损失,20 15 10 5 0,minutes 灵敏度 2 k 10, 离子强度;梯度淋洗,26,选择因子对分离度的影响,=, =,tR2 tR1, ,t t,R

12、2 R1,tR2 -t0 tR1 -t0,25 20,可以通过以下途径改变：,15, ,改变固定相 改变流动相或离子强度 改变柱温 改变化合物电离状态,0,2,8,10,4minutes6,10 5 0,t0,tR2,27,选择性是分离度的关键,R 分离度 N 理论塔板数 选择性 k 容量因子,例如: 在5-m,150 mm C18 色谱柱上分离一对峰, 假如 N = 10,000 塔板/柱, k 1且 = 1.01 Rs = 1 若将 R提高到 2，以达到基线分离,方法 1 增加 N 方法 2 提高 ,需要提高N 6400% （ N = 640,000） 需要提高 1% （ = 1.02）,

13、提高分离度最有效的方法就是更换不同固定相类型的色谱柱,28,Rs与N、K及 的关系图示,29,液相色谱应用技术,戴安中国有限公司,30,使用文献方法注意点 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度）,31,如何建立一个HPLC方法必须具备如下条件 流动相类型 运行程序 梯度方法 等度方法 流速 进样量 色谱柱及柱温 检测器,32,完整的HPLC方法（色谱条件） 所需的基本方法参数 液相色谱实验所需的基本参数, ,检测器参数：紫外检测波长

14、，灵敏度等 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相：种类及配比，等度或梯度 流动相输送系统参数：流速 温度控制 进样量,33,方法参数的选择及其影响,34,方法参数的选择及其影响 选择HPLC检测器 选择合适的色谱柱 反相色谱常用流动相,35,一）选择HPLC检测器 没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！ HPLC检测器可以分为： 溶质性质检测器（选择型） 对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型） 整体性质检测器（通用型） 不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）,36,选择液相色谱的检测器,通用检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感

15、 破坏性 选择性检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性,RI ug 104 是 是 否 ABS ng 105 否 否 否,ELSD ng 否 否 否 是 FL pg 103 否 否 否,CAD ng 104 否 否 是 EC fg 106 是 是 是,Cond pg 105 是 是 否,MS pg 103 是 是 是,37,理想的HPLC检测器 高灵敏度；可忽略基线噪音 宽的线性范围 对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性,38,6:1,灵敏度：信噪比 灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N） 检测限（LOD）：S/N =

16、 3 定量限（LOQ）：S/N = 10 好的信噪比有利于： S 更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性,N,39,选择液相色谱的检测器 要考虑的因素： 你要分离的化合物/样品的化学特性 化学结构、分子量及紫外光谱等等 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等） 梯度还是等度 灵敏度需求 采样频率 是否有双检测的需求,40,吸光度（ UV/Vis）检测原理 原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：比耳定律，AKCL 优点：1）对温度和流速不敏感 2）可用于梯度洗脱 3） 灵敏度较高，ng级检测 缺点：选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质,41,吸光度（

17、UV/Vis）检测的应用 大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测定大多数的化合物，是 目前实验室中使用最多的检测器 多数公司售出的检测器中75%以上是吸光度检测器（包括紫外/可见检测 器和二极管阵列检测器DAD）,42,光电二极管矩阵（Photo Diode Array）,Photo DiodeArray 简称：PDA或DAD,43,光电二极管矩阵检测器（DAD ）的特点和用途 一种三维水平的吸光度检测器采集三维谱图,兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息, 在收集色谱图的同时，得到光谱图 提供许多有用的功能 色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认 可以发现单波长检测时未测到的峰 任意波长的色谱再处

18、理 光谱信息 光谱库的建立检索和拟合,44,荧光（Fluorescence）检测原理, 原理：发荧光的化合物吸收光（UV或VIS）使其分子达到激发态，当其 返回到基态时发射光的现象即荧光 优点：荧光检测器灵敏度高, pg级检测 缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需要衍生,45,荧光检测器原理,46,多环芳烃（PAH）,荧光检测器的应用 环境中的污染物 多环芳烃(PAH)，多酚，氨基 甲酸酯等, 食品、饮料,CH3,H3C,CH3,CH3, 食品中的毒素；例如：黄曲 霉毒素,OH,维生素, 染料, 维生素及衍生氨基酸 生物技术及制药,O,O,CH3,O,O,O,O,O,NH,CH3,H3C,O

19、,CH3,O 黄曲霉毒素,CH3 氨基甲酸酯类杀虫剂,47,示差折光（Refractive Index）检测 示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十 年代末、七十年代初） 通常被认为是一种通用检测器 检测溶液中所有被溶解的溶质 非特异性 任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值,S,R,48,示差折光（RI ）检测 的原理 原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样各组分浓度 优点：通用型检测器 缺点： 1）对温度变化敏感 2）不能用于梯度检测 3）灵敏度低，ug级检测,49,示差检测器的应用 示差折光检测器是通用型检测器,如果选择合适的溶剂，几

20、乎所有的物质都 可以检测 特别适用于检测没有紫外吸收的化合物,例如糖类,醇类,酯类以及脂肪酸等 高分子化合物GPC,GFC分析以及复杂样品纯化,50,蒸发光散射（ELSD）原理, ,用氮气把流动相吹成细雾状 流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉 蒸发的溶剂被从检测器中除去 溶质的挥发性小于流动相，因此产生颗粒束与光束相交 被颗粒散射的光由光电倍增管（PMT）收集 PMT的输出与溶质的存在量呈比例关系,51,ELSD 优点及应用领域 通用型 比流动相挥发性小的物质都能被检测 可以作梯度实验； 检测下限可到纳克级水平 对环境条件不敏感；可以使用有强紫外吸收的溶剂作流动相 应用领域： 碳水化合

21、物 油脂及脂肪酸 未衍生的氨基酸 制药行业 表面活性剂 天然产物,52,ELSD 缺点, ,不能使用不挥发性的流动相（例如：磷酸盐） 要求使用雾化气源（典型的是氮气或空气） 不同的色谱条件下雾化及除溶剂的参数需要重新优化 破坏性技术 蒸发出的溶剂要引到户外或通风橱里 对挥发性化合物的检测不理想 一般得到的是非线性校正曲线 某些化合物的检测灵敏度不如其他检测器,53,新型液相色谱通用型检测器：Corona电喷雾检测器 CAD(Charged Aerosol Detectors)是 ESA独特的专利技术 近期发展最快的HPLC通用型检测技术 目前，世界上许多制药、化学、食品饮料和化妆品行业使用该检

22、测器， 应用于开发和生产环节,54,CAD检测器,Corona “classic”,Corona Ultra,55,10,Corona CAD电喷雾检测器原理图 1 3 2,4,6,8,9,5,7,56,二）选择合适的色谱柱 色谱柱类型 反相柱C18、C8、苯基、内嵌极性基团等 正相柱硅胶、氨基柱、氰基、乙二醇柱等 离子交换色谱柱 WAX、WCX、SCX等 特殊色谱柱：手性色谱柱(刷型、淀粉类、纤维素类、环糊精类等) ； 凝胶色谱柱；免疫亲和色谱柱等 规格 长度、内径、粒径、孔径等 品牌、批号 Acclaim系列、Zorbax系列、Atlantis系列、国产色谱柱等,57,对色谱柱要有足够的了

23、解,掌握柱子分离机理 自己建立开发方法,58,根据分析物的分离机理分类 吸附色谱（正相色谱） 分配色谱（反相色谱） 离子交换色谱 体积排阻色谱 亲和色谱,59,正相色谱柱 吸附色谱（正相色谱） 常见固定相类型 C = N 氰基柱,NH2 氨基柱,Si-OH 硅胶柱,HO OH CHCH2 乙二醇柱,以吸附为主要保留机理(相似相容) 常用非极性流动相，如正己烷、四氢呋喃等 极性小的化合物先被洗脱下来,60,反相色谱柱 分配色谱（反相色谱） 常见固定相类型,O,Me N,O,O S,C,N,O,以“液-液分配”为主要分离机理 常用极性流动相，如甲醇、乙腈和水等等 极性大的化合物先被洗脱下来,61,

24、反相键合相色谱柱 以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基 质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填料的70-80% 优点 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点 pH值不能小于2或大于8 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同,62,不同类型色谱选择性差异,色谱柱: 规格:,如色谱图, 5-m 150 mm x 4.6 mm,4,6,5,流动相: 温度: 流速: 进样量:,CH3CN/25 mmol/L 磷酸盐, pH 3.3 (60/40 v/v) 30C 1 mL/min 5 L,检测:,UV, 206 nm,4,AU,峰:,3,5,6,

25、1. 尿嘧啶 2. 嘧啶 3. 苯酚 4. N,N-二甲基苯胺 5. 甲苯,7.5 g/mL 50 50 50 60,6. 4-丁基苯甲酸,50,0,2,8,10,4 Minutes6,63,不同品牌C18区别,4,2 3,Column: Eluant: Flow rate:,如图所示 90% MeOH 1 mL/min,品牌 B,2,3,4,2,1,Temperature: Peaks:,30 C 1.,品牌 A,1,3,4,2. 3.,0,2,4,6,8,10,4.,Minutes,64,离子交换色谱柱 离子交换色谱 常见固定相类型 弱阴离子交换：结合阴离子 弱阳离子交换 结合阳离子 流动

26、相常为不同pH的缓冲盐 常用来分析离子型化合物 溶质必须为带电状态才能具有离子交换的能力,65,小分子分析面临的挑战 RP 柱 (如C18) 用途最广泛,但： 存在残余硅羟基作用,在中性淋洗液条件下，碱性化合物拖尾 对高极性（亲水性）化合物保留很弱 选择性有限 RP柱+ 离子对试剂 分离亲水性带电化合物 平衡时间长 流动相复杂 (MS 不兼容) IEX 柱-分离带电化合物 疏水性差，限制了使用 HILIC/NP柱-分离高度亲水的化合物 疏水性差，限制了使用,66,混合模式固定相 定义 疏水性相互作用 + 离子交换作用 类型 WAX/RP, SAX/RP WCX/RP, SCX/RP 两性离子/

27、RP, 两性/RP 优势 选择性可调节 流动相组成简单 可同时分离不同类型的化合物,67,各种不同的混合基质制作方式,硅,胶,硅,胶,硅,胶,I. 混合填料 Hypersil Duet C18/SAX (Thermo Scientific),II. 混合键合 Alltech Mixed-Mode (Grace),III. “内嵌” Primesep Mixed-Mode (SIELC),IV. “封尾” Acclaim Mixed-Mode (Dionex),反相 蓝色; 离子交换 红色,68,体积排阻色谱柱 体积排阻色谱 常见固定相类型 凝胶过滤色谱（GFC）：亲水性固定相-聚乙烯醇、硅胶等

28、 凝胶渗透色谱（GPC）：疏水性固定相-聚苯乙烯-二乙烯基苯 化合物保留主要受色谱柱填料和尺寸影响 具有很好的预测效果，分子量大的化合物先出峰，分子量小的化合物后出峰 常用于测定高分子化合物的聚合度 常用于生物活性分子的分离,69,亲和色谱柱 亲和色谱 常见固定相类型如右图所示，通过 固体载体连接一个具有识别能力的 配体 “Lock and Key”(锁与匙)的识别 机理，专一性很强 常用于生化样品的纯化、分离,70,三）反相色谱及常用流动相 反相色谱的主要类型，基于样品分子的极性分离 反相色谱的固定相（填料）为非极性，流动相为极性。用得最多约占70- 80% 洗脱次序：一般为反相，即极性高的

29、先被洗脱,71,流动相极性,溶剂,极性,非极性,水,甲醇 异丙醇 乙腈,THF,乙酸乙酯,CH2Cl2,CHCl3,己烷,NH3X/ArOH/RCOOH,CNH2,ROH,RCN 醛/酮,N(R)2,NO2,卤代烷烃 烷烃,COOCH3 样品的官能团,CH3,72,流动相洗脱强度, 反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度： 水 甲醇乙腈 乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃 最常用的流动相组成“乙腈-水；甲醇-水” 正相色谱最常用的流动相及其洗脱强度： 正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇 *应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法,73,流动相的选择原则, ,样品易溶，且溶解度尽可能大 化学性质稳定，不损坏柱子 不妨碍检测器

30、检测，所选波长处无吸收 * 黏度低，流动性好 * 无毒或低毒，易于操作 易于从其中回收样品 易于制成高纯度，即色谱纯 废液易处理，不污染环境,74,常用流动相 反相体系 有机相：ACN、MeOH等 水相：H2O、磷酸缓冲盐(pH2、7、12)、醋酸缓冲盐(pH4.5)、硼酸 缓冲盐(pH9、13)、三羟甲基氨基甲烷(Tris，pH8)等 改性剂：三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)等 正相体系 正己烷、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯等 乙醇、异丙醇等,75,缓冲盐的选择 缓冲盐类型 挥发性：TFA、醋酸盐、甲酸盐、TEA等 非挥发性：磷酸盐、硼酸盐等 离子强度 弱极性化合物分离：0 10 mM

31、中、高极性化合物分离：20 30 mM 离子交换：60 100 mM pH值,76,流动相pH对分析的影响,Acids,Base,中性化合物的保留与pH无关 酸、碱性化合物的保留受pH影响 可通过调节pH确定未知化合物的酸、碱性,77,苯胺 2,mAU,啶 1 尿嘧,胺 4 对乙基苯,苯酚 3 -,甲苯 5 ,6 乙苯,流动相pH对分析的影响,WVL:254 nm,90 75 63 50 38 25 13 0,0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,min 10.0,-10,中性化合物： 甲苯,碱性化合物： 苯胺 pKa=9.9,酸性化合物： 苯酚 pK

32、a=2.7,78,mAU,流动相pH对分析的影响,50,NH 2,40 30 20,pH 6 pH 5 pH 4 pH 7,pH 8,T=40C, F=1mL/min ACN/20mM Phosphate buffer/H2O 35/35/30 v/v/v,10 0,0,0,0,5,1,0,1,5,2,0,2,5,3,0,3,5,t min,79,ce mAU Absorbanc,AU bsorbance m Ab,1,2,MeOH vs. ACN 600 250 MPB：MeOH 1 -100,3.00,3.50,4.00,4.50,5.00,550,Retention Time min 1

33、 2,250,2,MPB：ACN,3.00,3.50,4.00,4.50,5.00,-50,Retention Time min 压力：MeOH-132bar；ACN-76bar；ACN洗脱能力更强；ACN选择性更好 峰1-邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)；峰2-邻苯二甲酸丁酯(DBP),80,粘度曲线,25oC,20oC,79,Proprietary & Confidential,系统压力与流动相粘度直接有关,81,样品溶剂对分析的影响 样品溶剂洗脱能力须等于或小于流动相初始洗脱能力,3,2,4 5 6,1,A) 样品溶剂： ACN,1,2,3,4,1,2,3,4 5 6,0,1,2,3,4,B

34、) 样品溶剂： ACN/H2O 50/50 (v/v),1,2,3,6,4 5,0,1,2,3,4,C) 样品溶剂： ACN/H2O 30/70 (v/v),t min 样品溶剂洗脱能力须等于或小于流动相初始洗脱能力,82,mAU Absorbance,流动相比例,200,1,2,4+5,3,WVL:210 nm ACN：H2O = 30：70,150,6,7,100,1 2,1+2,4,50,2,6,5,3,7,ACN：H2O = 40：60,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,20.0,-10,Retention Time min 有机相比例增加，出峰

35、更快、压力不同、选择性不同,83,流速对分析结果的影响,0,450 300 150,1 mL/min,C5,C4,C1 C2,C3,Uracil,450,0,1,2,3,4,450,300 150 0,1.5 mL/min,0,1,2,3,4,450,300 150 0,2 mL/min,0,1,2,3,4,450,300 150 0,2.5 mL/min,0,1,2,3,4,300 150 0,3 mL/min,Time min,0,1,2,3,4,流速增加，出峰更早，一般选择性不变,84,柱温对分析结果的影响,1,21C,7,2,3,4,5,6,1,3+4,6+7,0,5,10,15,20

36、,25,30C,2,5,0,10,20,25,2,6,1,3,5,15 7,40C,5 4,0,5,10,15,20,t min 25,柱温增加，出峰更早，选择性变化,85,方法开发的具体步骤,86,方法开发和优化的具体步骤, ,选定一根色谱柱（先用较短的柱子） 先用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k 值改变保留值（普通反相-简单常用的方法） 调节a值改变选择性（方法优化）, 通过改变流动相的pH值，使样品成中性 加入 “对离子”，使样品呈中性 选择更合适的柱子 调节柱长度，流速，梯度，改变柱效及分离速度 请记住 每次改变一个参数,87,液相色谱的方法开发（一

37、） 改变流动相比例及组成 （非极性和弱极性化合物）,88,改变流动相比例及组成（实例1） 非极性和弱极性化合物, 色谱条件 流动相：洗脱强度由强到弱，改变容量因子 K 1.有机相从100%开始逐渐降低 2.走梯度 举例中： 乙腈/水，流速：1ml/min 用不同的溶剂强度以 60/40、50/50、40/60，由强渐弱 色谱柱：C18，4.6mm15mm 样品： 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben),89,改变容量因子 K,谱图,50/50,40/60, 60/40, , ,90,调节

38、值改变选择性 同样强度的不同有机溶剂，改变了流动相值,CH3CN / H2O 38:62,THF / H2O 28:72 MeOH / H2O 58:42,91,液相色谱的方法开发（二） 方法优化离子型化合物的色谱分离,92,方法优化 离子型化合物 离子抑制法 离子对色谱法 离子交换色谱柱 色谱峰拖尾 添加改性剂 使用梯度,93,方法优化离子型化合物的色谱分离, 多数化合物是离子型的！ 使用反相柱 离子抑制色谱法：通过改变流动相的pH值，使样品成中性 离子对色谱法：加入“对离子”，使样品呈中性 使用离子交换柱：离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子 使用疏水和离子交换混合模式柱子 主要用于“弱”

39、阴、阳离子,94,方法优化离子抑制色谱 离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离使样品成中性 适用于弱酸性化合物的分离 加入TFA,磷酸盐等降低流动相的pH值，使样品降低离子化 仍使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内,95,方法优化 离子抑制,O R-C-O-H,10 9 8 7,6 5 4 3,k,弱碱 弱酸,2 1 0,O R-C-O-,2,4,8,6,pH = pKa,pH 离子抑制色谱法,96,方法优化 离子抑制,O R C O H + H2O,O R C O + H3O+,保留最弱,保留最强,O

40、 R C O 和 O R C O H pH = pKa,O R C O 高 pH,O R C O H 低pH,97,液相色谱的方法开发离子抑制色谱（实例2）,CHO,COONa,CHO,COOH,而在乙腈/水并且pH=7时，,OH,OCH3,OCH3,1,2,3,4,苯甲酸纳 苯甲醛 对甲氧基苯甲酸,多数组份保留时间很短，无 法完全分离。,三甲氧基-四羟基苯甲醛,98,方法优化离子抑制色谱的使用范围 下列情况下不能使用离子抑制方法： 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化 可以有以下的选择 使用“离子对色谱法” 离子交换色谱柱 甚至要采用离子色谱仪分析,99,方法优

41、化离子对色谱法 在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离的组份形成“对离子” 在反相色谱柱上分离离子型化合物 离子对试剂的类型 季铵盐、叔胺盐 （正离子），适用于弱酸 烷基磺酸盐、高氯酸盐（负离子），适用于弱碱 烷基长度不同，形成对离子的能力不同,100,方法优化 离子对,+ N,SO3 Na+,键合相,离子对试剂,+ N,H2PO4,R,SO3,样品,+ H,O O C R,R N R,用季胺烷基三乙基胺分离酸 三乙胺 (TEA) 磷酸四甲基铵 (TMA) 四丁基溴化铵 ,用烷基磺酸盐分离碱 三氟乙酸 (TFA) 七氟丁酸 (HFTBA) 己烷磺酸钠 十二烷基硫酸钠 ,101,容

42、量因子,方法优化 离子对 优化参数 离子对试剂的种类 离子对试剂的浓度,20 15,十二烷基, 流动相组成，包括pH、,有机相含量等,10,辛基,5 0,己基 丁基,0,20,40,60,烷基硫酸钠 mM,102,NaO 3S NaO 3S,SO3Na SO3Na,液相色谱的方法建立离子对色谱（实例3） 光敏物质 1,3,6,8-芘四磺酸四钠盐 长激发态寿命，与其他物质组成光敏物质 未见相关色谱分析报道 离子型化合物 在C18柱上无保留，如右图 色谱分析 离子抑制法（不合适） 阴离子交换法（不理想）,8-, 离子对色谱法（好）,1,3,6,8 芘四磺酸四钠盐,103,e mAU Absorba

43、nce,方法优化 离子对 600,NaO 3S,SO 3Na,色谱柱: 流动相A:,Acclaim C18，120， 4.6 *150 mm *5 m at 40 C 25 mM 四丁基溴化铵，,20 mM KH2PO4，pH 2.5,400,流动相B: 流速: 进样量:,CH3CN 1.5 mL/min 5 L,200,NaO 3S,SO 3Na,检测:,UV, 282 nm,梯度：,Time (min),B%,-5,20,0 5,20 70,t0,0 -150,70,10 离子对色谱法,0.0,1.3,2.5,3.8,5.0,6.3,7.5,8.8,10.0,Retention Time

44、min,104,液相色谱方法建立三聚氰胺分析离子对色谱（实例4） NH2,N,N,N,NH2,H2N,C18柱上离子对色谱法(实例4) SCX强阳离子交换色谱柱(实例5) 疏水性作用 + 离子交换作用混合模式柱子(实例6),105,三聚氰胺 反相C18柱 离子对方法,GB/T 22338-2008 原料乳和乳制品中三聚氰胺检测方法,106,12.653 1 -,1,560 2 - 三聚氰胺 - 14.5,527 3 - 15.5,三聚氰胺 反相C18柱 离子对方法,标准样08 三聚氰胺2 三聚氰胺加标,0.0,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5,15.0,17.5,20.0,UV_VI

45、S_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1 WVL:240 nm min,1 - 221 #3 2 - 221 #7 30.0 3 - 221 #8 mAU 25.0 20.0 15.0 10.0 5.0 3 0.0 2 -5.0 1 -10.0,图A.1,标准，液体奶样品及加标三聚氰胺奶样品的 HPLC色谱图。,三聚氰胺保留时间14.56min GB/T 22338-2008 原料乳和乳制品中三聚氰胺检测方法,107,液相色谱的方法建立三聚氰胺分析 SCX强阳离子交换色谱柱离子交换方法（实例5a）,GB/T 22338-2008 原料乳中三聚氰胺快速检测 （液相色谱法）,108,三聚氰胺 SCX强阳离子交换色谱柱(实例5a),G