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1、资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。PCR-DGGE技术一、 实验原理变性梯度凝胶电泳( denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)最早是Lerman等人于20 世纪80 年代初期创造的,起初主要用来检测DNA 片段中的点突变 。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术 ,温度梯度凝胶电泳 ( TGGE) 。该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域 ,当前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。双链 DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时 , 其迁移行为取
2、决于其分子大小和电荷。不同长度的 DNA片段能够被区分开 , 但同样长度的 DNA片段在胶中的迁移行为一样 ,因此不能被区分。DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上,加入了变性剂 ( 尿素和甲酰胺 ) 梯度 ,从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。一个特定的 DNA片段有其特有的序列组成 , 其序列组成决定了其解链区域和解链行为。一个几百个碱基正确 DNA片段一般有几个解链区域 , 每个解链区域有一段连续的碱基组成。当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时 , 该区域这一段连续的碱基对发生解链。当变性剂那浓度再升高依次达到其它解链区域浓度后 , 最高的解链区域也发生解链 ,
3、从而双链 DNA完全解链。不同的双链 DNA片段因为其序列组成不一样 , 因此其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。当进行 DGGE电泳时 , 一开始变性剂浓度比较小 , 不能使双链 DNA片段最低的解链区域解链 , 此时 DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦 DNA片段迁移到一特定位置 , 其变性剂浓度刚好能使双链 DNA片段最低的解链区域解链时 , 双链 DNA片段最低的解链区域立即发生解链。 部分解链的 DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。 因此同样长度但序列不同的 DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度 , 因此它们会在胶中不同
4、的位置分开。然而 , 一旦变性剂浓度达到 DNA片段最高的解链区域变性剂浓度时 , DNA 片段会完全解链 , 成为单链 DNA分子 , 此时她们又能在胶中继续迁移。 因此如果不同 DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时 , 这些片段就不能被区分开来。 在 DNA片段的一端加入一段富含 GC片段能够解决这个问题。含有 GC夹子的 DNA片段最高的解链区域在 GC资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。夹子这一段序列处 ,它的解链变性剂浓度很高,能够防止 DNA片段在 DGGE胶中完全解链。当加入 GC夹子后 , DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能区分开来。二
5、、 实验步骤1. 样品预处理2. 样品 DNA的提取及纯化提取方法根据各样品特点自主选择。3. PCR 扩增 Touchdown PCR method用于 DGGE的 PCR引物及其扩增程序 :（1） V3 区的 DGGE引物 200bp左右的片段正向引物 :341F-GC(5-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAG);5 GC-clamp,有利于检测发生于高熔点区的突变.反向引物 :518R (5 GTATTACCGCGGCTGCTGG3)PCR条件 :10x PCR buffer2.5ulMgCl (25mmol/L)2
6、.5ul2dNTP(10mM/L)0.5ulforward-pri(10pmol/ul)0.5ulreverse-pri(10pmol/ul)0.5ulTemplate DNA12 uladd ddH2O to 25ulPCR程序 :945min ( Taq added)941min651min资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。721min-20 cycles之后每两个循环降低复性温度1-941min551min721min941min551min10 cycles721min727min（2） V3 V5区的 DGGE引物高于 500bp的片段 Bacterial
7、正向引物 341357:341F-GC(5-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCA);反向引物 907926:907R(5CCGTCAATTCMTTTGAGTTT)-3PCR程序 :945min ( Taq added)941min651min721min-20 cycles之后每两个循环降低复性温度1-941min资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。551min12 cycles723min727min Archara正向引物 344363:ARC344F-GC( 5 - CGCCCGCCGC
8、GCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGACGGGGYGCAGCAGGCGCGA)-3反向引物 915-934:ARC915R( 5 -GTGCTCCCCCGCCAATTCCT)-3PCR程序 :945min ( Taq added)941min651min721min-20 cycles之后每两个循环降低复性温度1-941min611min12 cycles721min7210min（3） V6 V8区的 DGGE引物 480bp左右的片段正向引物 : 968F( 5 -CGCCGGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAA
9、CCTTA3)反向引物 :资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。1401R( 5 -CGGTGTGTACAAGACCC)-3PCR程序 :945min ( Taqadded)941min651min723min-20 cycles之后每两个循环降低复性温度1-941min551min15 cycles721min7210min4. 预实验 ( DGGE 条件优化 )DGGE有两种电泳形式 :垂直电泳和水平电泳。前者是指变性剂梯度或温度梯度的方向和电泳方向垂直 ;后者是指两个方向是平行的。在分析微生物群落的PCR 扩增产物时 , 一般先要用垂直电泳来确定一个大概的变性剂范
10、围。 垂直电泳时 , 胶从左到右是变性剂梯度。在胶的左边 , 变性剂浓度或温度低 , DNA 片段是双链形式 , 因此沿着电泳方向一直迁移。在胶的另一边 , 由于变性剂浓度或温度高 , DNA一进入胶马上就发生部分解链 , 因此迁移很慢。在胶的中间 , DNA 片段有不同程度的解链。在变性剂浓度或温度临界于 DNA 片段最低的解链区域时 , DNA 的迁移速率有急剧的变化。因此 , DNA 片段在垂直胶中染色后呈 S 形的曲线 , 根据垂直电泳确定的范围 , 再用水平电泳来对比分析不同的样品。5. 制胶资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。( 1)试剂配制 40% 丙烯
11、酰胺 / 甲叉双丙烯酰胺 (Acrylamide/Bis 37.5:1)RagentamountArylamide38.96gBis-acrylamide1.04gAdd ddH2Oto 100ml 10% 过硫酸氨 (Ammonium persulfate)ReagentamountAmmonium persulfate0.1gAdd ddH O1.0ml2store at -20 for about a week 50 TAE BufferReagentAmountTris Base242g121gAcetic acid glacial (冰乙酸 )57.1ml28.55ml0.5M ED
12、TA pH8.0100ml50mlAdd ddH Oto 1Lto 500ml2Store at room temperature Denaturant stock solution (8.0%)For 100ml use:0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%40% Acrylamide/Bis (ml)2020202020202020 20202050TAE Buffer (ml)22 222222222Formamide (ml)0481216202428323640资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。Urea (
13、g)0 4.2 8.4 12.6 16.8 21 25.2 29.433.637.8420%25% 35% 45% 55%65% 75%40% Acrylamide/Bis (ml)2020202020202050TAE Buffer (ml)222222 2Formamide (ml)0101418222630Urea (g)010.5 14.718.923.127.3 31.5( 2) 制胶高浓度端 : Syringe,高浓度胶70% Denaturant/8.0% gel 10ml14.5ml20ml24ml10% APS80l116l160l192lTEMED6l8.7 l12l14.4 l低浓度端 : Syringe,低浓度胶30% Denaturant/8.0% gel 10ml10% APS80lTEMED6l上相非变性胶5ml0% Denaturant/8.0% gel40l10% APS3lTEMED( 3)制胶步骤按照 Bio-Rad 475 型梯度生成仪使用说明书操作。具体操作步骤见视频教程及网上资源 ( Harvard)。灌完胶后 ,立即用水冲洗注射器,避免凝固 ,并用水饱和正丁醇封胶,使液面水平保持水平。