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1、,实验三 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,（Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins）,1,教育材料,1、掌握电泳法分离蛋白质的原理 2、熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的操作、注意事项 3、熟悉测定血清中各种蛋白质相对百分含量 的方法 4、了解AG的临床意义,实验目的,2,教育材料,分离蛋白质的方法,3,教育材料,电泳,依据分子或颗粒所带电荷、形状、大小等不同，因而在电场介质中移动速度不同，从而达到分离的技术。,一、电泳,4,教育材料,阴离子，向正极移动,阳离子，向负极移动,5,教育材料,电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单
2、位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即,V粒子运动的速度 X电场强度 Q粒子所带电荷 r粒子的半径 介质的粘度,6,教育材料,二、电泳的影响因素,分离样品的性质 电泳介质的pH 缓冲液的离子强度 电场强度 电渗作用,7,教育材料,电渗作用,在电场中液体对固体支持物的相对移动.,如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快； 如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。,8,教育材料,三、电泳的分类,支持介质不同,纸电泳（Paper electrophorisis）,醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis）,琼脂凝胶电泳（Agar Gel elect
3、rophoresis）,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）,9,教育材料,支持介质装置形式不同：, 平板式电泳 ； 垂直板式电泳 ； 垂直柱式电泳,pH 的连续性不同： 连续pH 电泳 非连续pH 电泳,10,教育材料,血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins,11,教育材料,本实验以醋酸纤维膜为电泳支持物，分离各种血清蛋白。 醋酸纤维膜是由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中。,实验原理,12,教育材
4、料,醋酸纤维素较纸电泳的优点,电渗作用影响小 醋酸纤维素膜对蛋白的吸附小，几乎无“拖尾”。 由于醋酸纤维素亲水性小，所容纳的缓冲液也较少，电流大部分是由样品传导，所以分离速度快。,醋酸纤维素是纤维素（纸）的醋酸酯,13,教育材料,血清蛋白质,清蛋白和球蛋白,清蛋白和1、2、-球蛋白,电泳,14,教育材料,血清蛋白的等电点pI大多在7.5以下，在pH为8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点及形状也有差异，在电场中迁移速率不同，可以在醋酸纤维素薄膜上分离成清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、r球蛋白五个区带 。,预测电泳谱是什么样？,15,教育材料,血清蛋白电
5、泳的正常组分,16,教育材料,醋酸纤维膜电泳蛋白组分变化的临床意义（A/G）,17,教育材料,实验步骤,一、准备与点样,醋酸纤维薄膜电泳装置示意图,1、滤纸桥； 2、电泳槽； 3、醋酸纤维素薄膜； 4、电泳槽膜支架； 5、电极室中央隔板,18,教育材料,镊子取出 膜条,取一条2.58cm的膜条,充分浸透在巴比妥缓冲液中,滤纸吸去多余的缓冲液,无光面距一端1.5cm（大拇指宽）处作点样线,点样器下端粘上薄层血清,垂直 点样,加样时一定要呈直线，垂直分布均匀，这样泳动的区带整齐不歪。,19,教育材料,放置 膜条,平衡5 分钟,通 电,关闭 电源,点样面向下,点样端置于阴极,膜条贴 紧滤纸，拉直膜条
6、,电压：120v/160v,时间：10min/50 min,二、电泳,点样线勿与滤纸桥接触,通电后，不要用手或镊子接触电泳槽， 通电完毕，先切断电源，以防触电。,20,教育材料,21,教育材料,通电 完毕,浸于染色液（氨基黑10B）中,取出 膜条,三、染色、脱色,取出 膜条,3min,依次浸于漂洗液、,滤纸吸 干薄膜,各5min,直至 漂净,22,教育材料,白蛋白,1球蛋白,球蛋白, 2球蛋白,点样线, 球蛋白,23,教育材料,取试管6支，编号如下,四、定量 (两人的膜条共用),充分振荡、脱净染料,比 色650nm、定 量,15min,24,教育材料,原始数据：,表1 血清各蛋白质吸光值,仪器
7、型号： 吸收波长： 实验时间：,25,教育材料,实验结果,1计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。 清蛋白（2A / T）100 1球蛋白（ 1 / T）100 2球蛋白（ 2 / T）100 球蛋白（/ T）100 球蛋白（/ T）100,光密度总和T2A+12 ,2计算出清蛋白与球蛋白之比值（A/G） G=12,26,教育材料,注意事项,1.点样面为不光滑面，勿用手触摸感知； 2.点样量适中，垂直点样； 3.点样端接电泳仪负极； 4.膜条与滤纸需贴紧，拉直； 5.谨防触电。,27,教育材料,1、电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？ 2、电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质？各谱带为
8、何种成分？请分析原因。 3、电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？,实验思考讨论,28,教育材料,1.蛋白质的理化性质？ 2.蛋白质的盐析？ 3.蛋白质的显色反应有哪些？ 4.分离蛋白质的方法有哪些？ 5.层析技术的分类及各自的原理。 6.透析的原理？,实验四 血清-球蛋白的提纯,29,教育材料,30,教育材料,待分离大分子的性质,所带的电荷、分子大小和形状。分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。,pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大。pH过高或过低会引起蛋白质变性。,电泳介质的pH,31,教育材料,缓冲液的离子强度,离子强度过低，则缓冲能力差，不易维 持PH恒定； 离子强度过高，在待分离分子周围形成 较强的带相反电荷的离子扩散层（即离 子氛），降低了蛋白质的带电量，使电 泳速度减慢。 一般所用离子强度为0.02-0.2之间。,32,教育材料,电场强度,过高，产热，样品和缓冲液扩散增加，条带增宽。蛋白变性（当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置） 过低，电泳时间增加，缓冲液扩散减慢。,电场强度：电泳支持物上每厘米的电位差，也称电势梯度。,33,教育材料,