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1、一、概念、分类及应用,1,专业课堂,（一）、 两 个 概 念,生物芯片 主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。 基因芯片 技术是通过微阵列技术, 将高密度DNA片段阵列通过高速机器人以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。,2,专业课堂,微阵列芯片 （Microarray） 微型实验室芯片 (Lab-on-a-chip) 液体芯片 (Liquichip),（二）、生物芯片分类及应用,3
2、,专业课堂,Lab-on-a-chip,微型实验室芯片是通过在芯片上刻成微流路径从而将涉及生物检测的主要步骤样品准备/生化反应/结果检测整合在一张芯片上。,4,专业课堂,5,专业课堂,6,专业课堂,Liquichip,Bead , Capture molecule , Analyte , Reporter molecule是构成liquichip 的4个主要部分。 Bead上带有两种荧光，根据这两种荧光的比例可以 将bead分为多种。目前已有48种，正在开发中。 Capture molecule : 作用相当于探针，能特异性的与被检测物结合。 Analyte: 样品中被检测的成分。 Repor
3、ter molecule: 带有荧光的报告分子，能特异性的与被检测物结合。,7,专业课堂,Liquichip,反应的一般步骤： 1.先将capture molecule 结合在bead 上， 2.将这种标记了的bead与样品反应。Capture molecule 可以与相应的 analyte 特异性的结合， 3.此时再加入荧光标记的，特异结合analyte的reporter molecule。 4.检测：用liquichip workstation 进行检测。原理是同时对bead和reporter molecule 上的荧光进行检测。从而确定被结合的analyte的种类和数量。,8,专业课堂,
4、Liquichip技术特点描述,1基于bead的这种固相反应技术，具有 灵敏度高、信号强度高、灵活性好、所需样品量少的特点。 2与传统的蛋白芯片相比，有两大优势，反应速度更快，灵活性更好。 3由于检测方法的特点，在大部分的实验过程中，都不需要洗脱步骤，省时，且不会破坏反应的动态平衡。 4有配套的蛋白表达和纯化体系。（his-tag）,9,专业课堂,Lquichip应 用 领 域：,蛋白质定量 蛋白质功能研究 蛋白表达谱分析。 蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸相互作用的研究。包括：免疫分析、酶分析、受体-配基分析、蛋白质核酸相互作用分析分析。,10,专业课堂,微阵列芯片,蛋白芯片 基因芯片,11,专
5、业课堂,蛋白芯片(Protein Chips),高通量微阵列蛋白分析方法,利用抗体抗原结合原理，采用化学发光或荧光检测 标记抗体或抗原，来检测抗原或抗体。,12,专业课堂,蛋白芯片应用,免疫学分析 蛋白与蛋白之间相互作用 DNA与蛋白质分子相互作用,13,专业课堂,基因芯片,基因芯片是通过微阵列技术, 将高密度DNA片段阵列通过高速机器人以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。 微阵列技术巨大优势在于它可以并行地宏量获取生物信息，借助此技术发展的生物芯片则提供了以核酸杂交为基础的基因水
6、平的表达监控，多态性研究和基因分型。从而使我们对基因表达调控有更深入的了解。,14,专业课堂,基因芯片发展历史,15,专业课堂,基因芯片,按内涵划分： cDNA芯片 Oligo芯片:25mer(affymetrix), 70mer(Operon)， 80mer（Clontech）, 按功能划分： 基因组芯片： 检测某一基因是否存在，若 存在，拷贝数是多少。探针是DNA. 表达谱芯片：确定基因表达的途径与表达产 物。探针是RNA或cDNA 测序芯片：通过探针与微阵列的配对分析获 得探针的序列结果。,16,专业课堂,基因芯片应用,基因表达检测 多态性分析 遗传图谱定位 基因分型 通过杂交反应测定序
7、列,17,专业课堂,基因芯片应用领域,遗传疾病研究 癌症 家系遗传疾病 普通基因突变疾病 感染性疾病 药物筛选 动物植物遗传筛选育种 个人基因身份证 环境监测,18,专业课堂,（三）、生物芯片应用优势,高通量平行分析样品 自动化程度高省时省力 所需样品试剂少保护环境 成本低,19,专业课堂,生物芯片应用优势,生物信息数据累积 为生物信息公共数据库添加更多数据 有利于研究基因序列与生物表型之间的关系 有助于理解疾病发生的机制,20,专业课堂,二、 生物芯片制作技术介绍,21,专业课堂,生物芯片制作方法分类,22,专业课堂,原位合成 (In Situ Synthesis),化学合成 原子印章 原位
8、光刻合成,23,专业课堂,原位光刻合成,美国著名的Affymetrix公司率先开发的寡聚核苷酸原位光刻专利技术，是生产高密度寡核苷酸基因芯片的核心关键技术。,24,专业课堂,原位光刻合成原理,Light directed oligonucleotide synthesis. A solid support is derivatized with a covalent linker molecule terminated with a photolabile protecting group. Light is directed through a mask to deprotect and a
9、ctivate selected sites, and protected nucleotides couple to the activated sites. The process is repeated, activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be constructed at each site.,25,专业课堂,预先合成后点样(off-chip synthesis),接触式点样 非接触式点样,26,专业课堂,基因芯片点样的方式,接
10、触式点样-适合于DNA芯片的制作 即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样品留在固相支持物上,27,专业课堂,接触式点样,Best!,28,专业课堂,ArrayIt ChipMaker Pins,带有细槽的不锈钢针尖 载样能力: 200 to 600 nL 点样体积: 250 pL to 2.5 nL (pin size) 点样直径: 100 m to 500 m (pin size),Dipping of pin for sample pickup Touching of slide with pin to leave spot Control print volume with pin
11、 size,29,专业课堂,Stealth and Chipmaker Pin (TeleChem),30,专业课堂,Chipmaker 点样技术,31,专业课堂,Stealth Pins,32,专业课堂,33,专业课堂,TeleChem公司点样针技术 不断发展的专利针技术 共有30种针供选择,与斯坦福大学共同发展 专利 pin, 带样稳定，样品利用率高 单次带样可连续点样达200-1500次 特殊不锈钢材料，适用于各种溶液 实际点样直径75-250um,可根据不同样品选择相应pin 相当容易更换pin和pin head以适应不同需要,34,专业课堂,基因芯片点样的方式,非接触式点样-适合于蛋
12、白芯片的制作 它是以电磁阀或压电原理将样品直接喷至固相支持物表面,35,专业课堂,非接触式喷点技术,Thermal,Solenoid 螺线管,Piezoelectric,36,专业课堂,Synquad：通过高分辨率注射器泵和微螺线管阀门有机结合起来精确控制滴液 Piezoelectric：用压电晶体将液体从孔中喷出的压电技术，两个压电晶体同时加脉冲通电触发这两个压电晶体往喷管中间变形挤压喷管侧壁，喷管出现收缩压迫液体从喷嘴喷出。,37,专业课堂,非接触式点样：synQUAD Technology,38,专业课堂,Aspirate and Print for Making Arrays,39,专
13、业课堂,Characteristics of synQUAD Technology,Wide dispense range Low nanoliter to high microliter Excellent linearity Precise and accurate CVs typically less than 10% Precision less than 5% Non-contact dispense mechanism Easier mechanical alignment (384, 1536,) “On-the-fly” printing possible Capable of
14、 dispensing onto membranes or slides Multiple liquid handling modes Aspirate/Dispense Continuous Reagent Dispensing,40,专业课堂,synQUAD vs Piezoelectric Printing,synQUAD / nQUAD Patented by Cartesian Uses commercially available components Robust and reliable delivery mechanism Low nanoliter to low micro
15、liter dispense volume maximum density: 200 to 400 spots/cm2 Piezoelectric Abbott holds key patents on technology Dispense susceptible to air bubbles Mid-picoliter dispense volume 2500 spots/cm2,41,专业课堂,三、生物芯片检测系统,CCD扫描仪 非共聚焦激光扫描仪 激光共聚焦扫描仪,42,专业课堂,数值孔径与采光效率,NA 0.3 NA 0.8,NA = sin(), where is the angl
16、e of the cone,43,专业课堂,激光共聚焦（聚焦）,The fluorescence source is at the objective lens focus Light goes through the pinhole to the detector,44,专业课堂,激光共聚焦（非聚焦）,Fluorescence source below focus (e.g. out of focus) Out of focus light is mostly blocked at the pinhole,45,专业课堂,Confocal Artifact RejectionNo Pinho
17、le With Pinhole,Dust artifacts reduced by at least a factor of 10,46,专业课堂,CCD Camera Systems Advantages: Few moving parts Fast scanning of bright samples Disadvantages: NA limited to about 0.40: Less appropriate for dim samples Optical scatter can limit performance Need to “stitch” together large im
18、ages Confocal Laser Scanners Advantages Small depth of focus reduces artifacts high light collection efficiency. PMT detectors have the highest sensitivity in the visible range,47,专业课堂,DNAscope LM+ 激光共聚焦芯片扫描仪,48,专业课堂,x,x,y,z,x,MACROscope,Filters,49,专业课堂,How the Scan System Works F-theta Telecentric
19、Scan System,Sample,Scanning Mirror,Laser Scan Lens,B,A,C,50,专业课堂,How to scan a whole sample,Home Sensor,Scanning Mirror,Sample,Laser Scan Lens,51,专业课堂,DNAscope LM+ 优点 共聚焦面积宽 : 20mm70mm 可以扫描多种介质 (Images both Glass Slide Microarrays and CLONDIAG AT tubes) 背景噪声低，信噪比高 全自动成像，分析结果 Small footprint (W20cm x
20、 L30cm x H20cm),52,专业课堂,Imaging Arrays Both Dry & Wet,Dry PBS buffer,Cy3 Cy5,Cy3 and Cy5 labeled protein dotted on glass substrate and imaged at 5 micron resolution in both dry and wet formats,53,专业课堂,Tube 1,Tube 2,Cy3 Images of two Clondiag Array Tubes,54,专业课堂,四、生物芯片技术思路的比较,55,专业课堂,Comparison of DN
21、A Chip Technologies,Sensitivity of DNA chip based assays is a function of: Probe and target DNA/RNA (Complexity) Chip surface (autofluorescence & non-spec. bkg) Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency & crosshyb.) Hybridization efficiency (lots of factors) Detection technology (signal type
22、, efficiency, noise),Oligo-Chip cDNA-Chip Genomic Chip 20n or 80 n 50,000 n,sequencing,expression,expression,genomic analysis,56,专业课堂,cDNA芯片的缺点,由于不同的基因长短不同，Tm值各异，成千上万的基因在同一张芯片上杂交，使得杂交条件很难同一。 同一个体中总是存在一些基因家族的同源序列，加上有的物种存在基因重叠序列的相互干扰，使得传统的cDNA芯片的分辨能力受到限制，结果的准确性也受到影响。 有些组织中在DNA双链中的无意义链中存在重叠的基因；而且不同RNA的
23、剪切方式等基因表达方式很难用cDNA芯片来区分。 PCR产物是结合稳定的DNA双链，加入探针后在杂交中必然存在竞争性抑制，影响探针和模板的结合能力和稳定性，进一步影响cDNA芯片的分辨能力和结果的可信度，这对于低丰度的基因影响尤为明显。PCR产物浓度不均一也可能导致错误的结论。,57,专业课堂,寡核苷酸芯片比cDNA芯片的优点,探针序列经过系统优化，减少非特异杂交，能有效区分有同源序列的基因； 减少二级结构 及其对杂交结果的影响 杂交温度均一，提高杂交效率； 合成产物浓度均一，避免因样品浓度差异而造成点样量差异 ； 可以设计检测不同剪切方式的基因； 无需扩增，防止扩增失败影响实验 。,58,专
24、业课堂,预合成后点样系统的综合成本cDNA芯片,59,专业课堂,预合成后点样系统的综合成本自己合成寡聚核苷酸芯片,60,专业课堂,预合成后点样系统的综合成本应用Operon探针寡聚核苷酸芯片,61,专业课堂,Affymetrix技术平台综合成本,62,专业课堂,总结,采用Affymetrix公司的生物芯片系统平台比较适合于实力雄厚的科研实验室，可以在最短的时间内尽快获得精确可靠的并且可能是前人未曾获得的实验结果，并可在国际权威杂志上获发表，尽快在相关研究领域在国际领域占领一席之地。,63,专业课堂,总结,采用合成后点样的生物芯片平台比较适合于目标定位于研发、生产的实验室及生物公司。虽然购买芯片
25、点样扫描系统的经费看起来比购买Affymetrix系统的费用要低，研发的方向可以结合实验室的研究特点，比较灵活，但前期研究需要投入较大的人力、物力和时间，综合成本并不低，而且获得的芯片信息量小，可靠性较低，使用该系统生产的芯片为材料进行的研究一般为验证性工作，且因为材料的可靠性低，很难在国际权威杂志上获得认可。目前开发生产的生物芯片尚无获得医疗许可的产品。,64,专业课堂,五、生物芯片制作所需耗材,65,专业课堂,Microarraying Accessories（芯片配件）,Pins and Printheads,OmniGrid Slides and Reagents OmniGrid E
26、poxy(环氧基修饰) OmniGrid Amine(氨基修饰) OmniGrid Aldehyde(醛基修饰) Complete line of associated reagents,Hybridization Chambers HybChamber HybChamber Mica,66,专业课堂,Slides: Epoxy Aldehyde Amine,Buffers: Spotting Blocking Hybridization,OmniGrid Slides & Reagents芯片研究片基和试剂,67,专业课堂,Substrates,膜： S & S NC膜及Supercharg
27、e尼龙膜 玻璃片： S & S FAST CEL 醛基化、氨基化玻片 DAKO玻片 Telechem SuperClean/SuperAmine/SuperAldehyde,68,专业课堂,Hybridization Cassete,1. Telechem,2. Clontech Plastic Hybridization Cassete,69,专业课堂,Wash Station,70,专业课堂,基因公司芯片系统客户,71,专业课堂,完善的售后服务体系,基因公司在全国各主要地区设有7处维修站，其中直接为生物芯片设备提供维护、维修服务的工程师有4人，主要集中在上海和北京。这些工程师都具有多年的生物芯片相关设备的安装、调试、维护、维修经验 。 上海晶泰生物技术有限公司作为基因有限公司的全资子公司，该公司的生物芯片实验室拥有目前国内领先的生物芯片点样、扫描设备，以及相关的如杂交炉、洗涤工作站等全套的实验设备。同时，公司目前拥有生物芯片领域的大量专业技术人才，目前，生物芯片实验室拥有本科以上20人，硕士5人、博士5人。该公司对外提供涉及生物芯片领域的各项商业服务：点样、扫描、芯片设计制作等全方位的服务。,72,专业课堂,谢谢各位老师 ！,73,专业课堂,