第五章 凝胶过滤层析【高等教学】.ppt

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1、第五章 凝胶过滤层析,1,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第一节 概 述,凝胶过滤层析（gel filtration chromatography, GF或GFC）是20世纪50年代前后发展起来的一种按分子大小进行分离的纯化手段。 在众多分离计划中被广泛采用，不同的文献中采用了多种不同的称谓: 凝胶层析（gel chromatography） 排阻层析（exclusion chromatography） 分子筛层析（molecular sieving chromatography） 立体排阻层析（steric exclusion chromatography） 体积排阻层析（size exclu

2、sion chromatography, SEC）,2,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第一节 概 述,凝胶过滤具有的优势 : （1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温 和，回收率高，重现性好； （2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、 表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能 在不同pH、温度下进行； （3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面 宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡 肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、 核酸等大分子物质的纯化； （4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时 层析介质不需再生

3、即可反复使用。,3,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,一、凝胶过滤的概念 不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.,4,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,凝胶色谱分离原理,5,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,凝胶过滤分离蛋白质 的过程 （1）蛋白质混合物上柱； （2）开始洗脱，小分子进入凝胶颗粒内，大分子被排阻在颗粒外； （3）小分子被滞留而移动慢，大分子移动快，大小不同的分子开始分开； （4）大小不同的分子完全分开； （5）大分子已被洗

4、脱，而小分子仍在层析柱内。,6,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,二、生物分子的相对分子质量、分子大小和形状 每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；,7,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子

5、量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。,8,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,在生物大分子的分离中，决定该分子在层析时的保留时间长短即洗脱快慢的因素不仅仅是相对分子质量，分子形状的影响也很大。有着相同分子量，但是形状不同的分子，其保留时间不同。一般来说，分子量相同情况下，不对称程度增加会使分子更容易被阻挡在凝胶颗粒的网孔之外，导致保留时间变短。,9,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,三、凝胶

6、过滤的有关理论问题 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的颗粒。 凝胶柱的体积参数包括： 总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积； 外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液相体积的总和； 内水体积（inner volume, Vi），是存在于溶胀后的凝胶颗粒网孔中的液相体积的总和； 凝胶体积（gel volume, Vg），又称支持物基质体积（matrix volume of the support, Vs）或干胶体积，是凝胶颗粒固相所占据的体积，,

7、10,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,根据凝胶床的组成，总柱床体积等于外水体积、内水体积与凝胶体积之和： Vt=V0+Vi+Vg,凝胶柱体积参数示意图,11,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理, 洗脱体积和分配系数 洗脱体积Ve定义为自样品加至层析柱上部开始，至洗脱组分达到最大浓度（对映洗脱峰峰顶）时流经层析柱的洗脱液的体积.,12,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,凝胶过滤洗脱曲线示意图 （组分A为全排阻分子，组分B为部分渗透分子，组分C为全渗透分子）,13,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,所示层析图谱中，样品由三种组分组成。 组分A为全排阻

8、分子，分子量大于凝胶分级范围上限，不能进入 凝胶网孔，经凝胶颗粒间隙被洗脱，该组分的洗脱体积Ve等于外 水体积V0（Ve=V0）。 组分C为全渗透分子，分子量小于凝胶分级范围下限，完全渗透 进入凝胶网孔内，在正常洗脱条件下，与凝胶间不存在吸附作用 时，此类组分的洗脱体积是最大的，等于外水体积V0与内水体积 Vi之和（Ve=V0+Vi）。 组分B为部分渗透分子，分子量处于凝胶分级范围内，是此类凝 胶能有效分离的物质。根据组分B的分子量，该组分能以一定程 度进入凝胶网孔之中，其洗脱体积Ve处于组分A与组分C之间 （V0VeV0+Vi）。,14,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,凝胶过滤

9、层析是一种分配过程，凝胶颗粒内部吸附的溶剂为固定相，流经层析柱的洗脱剂为流动相，样品的洗脱过程就是溶质分子在两相中不断分配平衡的过程，而某种物质的洗脱体积Ve的大小取决于该物质在流动相和固定相之间的分配系数Kd，其关系式为： Ve = V0 + KdVi Kd的值与被分离物质的分子量和分子形状、凝胶颗粒间隙和网孔大小有关，与层析柱的长短、粗细无关。,15,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,对所有全排阻分子，由于Ve相同，凝胶过滤层析时两两之间无法实现分离，对所有全渗透分子同样如此。 如两种物质都是部分渗透分子但分子大小不同，其Kd值不同因而Ve也不同，可实现分离，这种部分渗透分子之

10、间的分离称为分级分离。 而不同类别分子之间，即在上图中组分A与组分B，或组分A与组分C，或组分B与组分C之间的分离称为组别分离。,16,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,当凝胶与被分离组分存在相互作用的情况下会出现Kd1的情况。 这种相互作用包括： （1）疏水作用 （2）亲和作用 （3）离子间的静电作用,17,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理, 凝胶过滤的分辨率 层析分离常采用分辨率（RS）来描述两种物质之间分离效果的好坏。分辨率定义为两个洗脱峰峰顶对映的洗脱体积之差比上两峰在基线上峰宽的和的平均值。,式中，Ve1和Ve2洗脱峰1和峰2的洗脱体积； Wb1和Wb2洗脱峰

11、1和峰2的峰宽。 RS是相邻两个洗脱峰相对分离程度的衡量标准。,18,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,分辨率Rs的定义,19,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,分离两种物质时分辨率取决于这两种组分的洗脱体积和峰宽。而决定组分洗脱体积和峰宽的因素包括两种组分的分子大小，凝胶柱的选择性和柱效。 选择性是一个系统分离大小不同组分的能力，习惯用相对保留值来表示，定义为： =（Ve2V0）/（Ve1V0） Ve1和Ve2组分1和组分2的洗脱体积； V0层析柱的外水体积。,20,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第二节 原 理,柱效用在特定实验条件下层析柱的理论塔板数N来表示通 常表

12、示为每米层析床所包含的理论塔板数，其计算公式： Ve组分的洗脱体积； Wh洗脱峰半峰高（h1/2）时对映的峰宽。 柱效还可用一个理论塔板的高度H来表示： HL / N 式中L为柱长。凝胶过滤时柱效的好坏取决于层析柱的填充效果，凝胶颗粒的尺寸，柱长，流速等因素，良好的装柱操作，较细的介质，较长的层析柱都有利于提高柱效。,21,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第三节 凝胶过滤介质,一、凝胶过滤介质的基本结构 凝胶介质的基本结构都是具有多孔网状结构的水不溶性多聚物。 理想的凝胶过滤介质必须符合以下条件： （1）有较强的机械稳定性，能满足层析过程所需流速，在其标称的操作压力范围内不发生体积变化； （2）

13、高化学稳定性，凝胶颗粒对分离过程中常用的试剂和样品都保持惰性，在很宽的pH范围内保持稳定，耐去污剂、有机溶剂，耐高温，从而方便清洗和消毒灭菌；（3）球形，颗粒直径均匀，呈现亲水性； （4）不带电荷，不对样品产生吸附作用。,22,高级教育,复 习,一、凝胶过滤的概念 不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的 时间不同,凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了 层析时该溶质在层析柱中的保留时间，不同的物质 因保留时间不同而分离.,23,高级教育,复 习,凝胶色谱分离原理,24,高级教育,复 习,凝胶过滤分离蛋白质的过程 （1）蛋白质混合物上柱； （2）开始洗脱，小分子进入凝胶颗粒内，大分子被排阻在

14、颗粒外； （3）小分子被滞留而移动慢，大分子移动快，大小不同的分子开始分开； （4）大小不同的分子完全分开； （5）大分子已被洗脱，而小分子仍在层析柱内。,25,高级教育,复 习,根据凝胶床的组成，总柱床体积等于外水体积、内水体积与凝胶体积之和： Vt=V0+Vi+Vg,凝胶柱体积参数示意图,26,高级教育,复 习,凝胶过滤洗脱曲线示意图 （组分A为全排阻分子，组分B为部分渗透分子，组分C为全渗透分子）,洗脱体积Ve定义为自样品加至层析柱上部开始，至洗脱组分达到最 大浓度（对映洗脱峰峰顶）时流经层析柱的洗脱液的体积.,27,高级教育,复 习,分配系数Kd 凝胶过滤层析是一种分配过程，样品的洗脱

15、过程就是溶质分子在两相中不断分配平衡的过程，而某种物质的洗脱体积Ve的大小取决于该物质在流动相和固定相之间的分配系数Kd，其关系式为： Ve = V0 + KdVi Kd的值与被分离物质的分子量和分子形状、凝胶颗粒间隙和网孔大小有关，与层析柱的长短、粗细无关。,28,高级教育,复 习,凝胶过滤的分辨率,29,高级教育,复 习,凝胶柱的选择性和柱效 选择性是一个系统分离大小不同组分的能力，习惯用相对保留值来表示，定义为： =（Ve2V0）/（Ve1V0） 柱效用在特定实验条件下层析柱的理论塔板数N来表示通常表示为每米层析床所包含的理论塔板数，其计算公式：,30,高级教育,复 习,理想的凝胶过滤介

16、质必须符合以下条件： （1）有较强的机械稳定性， （2）高化学稳定性， （3）球形，颗粒直径均匀，呈现亲水性； （4）不带电荷，不对样品产生吸附作用。,31,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第三节 凝胶过滤介质,二、 凝胶过滤介质的参数及性质 粒度 凝胶介质的粒度是指溶胀后的凝胶水化颗粒的大小，单位是微米（m）. 粒度越小，分离效果越好，但能分离样品量减少，限制了流速的提高，对层析设备的要求提高，因此细颗粒介质适用于分析型分离； 凝胶颗粒越大，柱效会下降，但可分离样品量提高，背景压力减小，因此大颗粒介质适合于中小规模的制备型分离。,32,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第三节 凝胶过滤介质, 交联

17、度和网孔结构 凝胶介质是具有三维网孔结构的颗粒，网孔结构是交联剂将相 邻的链状分子相互连接而成的（琼脂糖凝胶Sepharose除外）. 交联剂的用量决定凝胶颗粒的交联度. 交联度决定了凝胶的分级范围。,33,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第三节 凝胶过滤介质, 机械强度 作为凝胶过滤层析介质，具有一定的机械强度是必要条件,在层析操作时，层析柱承受的压力降和所采用的流速规定了介质必须具备的机械强度。 作为商品凝胶，其机械强度一般采用可承受操作压力范围（MPa）或最大线性流速（cm/h）来表示。,34,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第三节 凝胶过滤介质, 物理和化学稳定性 在物理稳定性方面，人们关

18、心的是介质能够承受高温高压的情况。 化学稳定性包含的内容较多,首先是pH稳定性,还有用酸或碱的稳定性.,35,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第三节 凝胶过滤介质,三、凝胶过滤介质的主要类型 按基质组成主要可以分为葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯-二乙烯苯凝胶、二氧化硅凝胶，以及由两种物质混合形成的如葡聚糖-琼脂糖混合凝胶、琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等。 按凝胶过滤层析能达到的柱效和分辨率，又可以将凝胶分为标准凝胶介质和高效凝胶介质。,36,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第三节 凝胶过滤介质, 葡聚糖凝胶 Sephadex称为交联葡聚糖凝胶，是最早问世且至今仍被广泛使用的凝胶过滤

19、介质，Sephadex是其商品名。 Sephadex凝胶按交联度不同，有一系列不同的型号，表示这些型号时采用Sephadex G加一个数字的方式，数字越小的介质交联度越大，分级范围越小，而数字越大的介质交联度越小，分级范围越大。 凝胶型号G后面的数字粗略表示了10克该类型凝胶的得水值（毫升），例如Sephadex G-10表示10克该凝胶能够吸收10毫升水，得水值1.00.1 .交联度越低的凝胶吸收水越多，溶胀时间越长。,37,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第三节 凝胶过滤介质, 琼脂糖凝胶 当热的琼脂糖（agarose）溶液进行冷却时，单个的链状分子之间会形成双螺旋，并进一步自发的聚集形成束

20、状结构，从而形成稳定的凝胶.,琼脂糖凝胶形成过程,38,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第三节 凝胶过滤介质,1. Sepharose 由于琼脂糖不经交联就能形成凝胶，因此可以直接作为层析介质. Sepharose在化学稳定性方面表现尚可，适用于多数凝胶过滤所涉及的实验条件。Sepharose的温度稳定范围较窄，在040，低于0会使颗粒结构遭受不可逆的破坏，而高于40凝胶会熔解。因此Sepharose不能承受高温灭菌，但可以采用化学方法灭菌.,39,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第三节 凝胶过滤介质,2.Superose 具有高分辨率、高机械强度、很宽分级范围的新型凝胶过滤介质,是在珠状琼脂糖颗

21、粒的基础上经过两次交联后得到的,适合与组分分子量差异较大的混合物的分离.,40,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第三节 凝胶过滤介质, 聚丙烯酰胺凝胶 与前两类介质不同，聚丙烯酰胺凝胶并非天然产物，而是通过化学方法合成的介质。 目前常见的聚丙烯酰胺凝胶是Bio-Gel P系列凝胶，根据交联度不同，该系列凝胶分为七个型号，分别用Bio-Gel P之后加一个数字表示，数字越大表示交联度越小，而数字越小则交联度越大。,41,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第四节 实验方案设计,为了成功地分离样品，必须根据样品特性和分离目的合理地设计出分离纯化实验方案。在设计实验方案时，应当考虑的因素主要包括凝胶过滤介质

22、或预装柱的选择，洗脱剂的选择，层析柱尺寸的控制，以及层析过程中有关参数的确定。,42,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第四节 实验方案设计,一、凝胶过滤介质的选择 分离目标和凝胶过滤介质的特性 根据分离样品的数量和目的，生化分离过程分为分析型和制备型分离。 分析型分离中样品的量较少，分离目的包括目标分子纯度测定，分子量测定，分子量分布分析，获取微量的目标分子等。 制备型分离涉及样品的量相对较多，分离目的包括对样品进行脱盐和缓冲液交换，去除混合物中的某些杂质，实验室小规模的获取目标物质，以及工业化制备某种物质等。,43,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第四节 实验方案设计,凝胶颗粒大小有粗、中、细、

23、超细等，其颗粒直径依次减小。一般情况下，粗规格的凝胶适合于对数量较多的样品进行分离，中规格的凝胶适合于少量、微量样品的制备，常规分析和测定，而细和超细规格的凝胶则适合于微量和极微量样品的分析。,44,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第四节 实验方案设计, 选择性曲线和分离范围 待分离物质的分子大小是决定选用何种介质的最重要因素，绝大多数情况下，所选凝胶的分级范围应当涵盖目标分子的大小。只有在这种情况下，介质才能对目标分子和其他大小不同的杂质分子表现出不同的选择性（），从而进行有效分离。,45,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第四节 实验方案设计,而凝胶的选择性是由基质的性质和结构所决定的，与流动相

24、无关，即凝胶过滤分离效果的好坏主要取决于介质，因此介质的选择十分关键。 凝胶介质的选择性曲线对于指导凝胶的选择很有帮助。选择性曲线是凝胶的重要参考指标，一般是通过溶质的有效分配系数Kav对溶质的分子大小作图得到。有时也可以用溶质的洗脱体积Ve对分子大小作图.,46,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第四节 实验方案设计, 样品和洗脱剂的特性 在分子量相同的情况下，分子形状不同的物质分配系数和洗脱体积相差很大。每种介质的选择性曲线都有针对球状蛋白和针对葡聚糖两种，应根据目标分子的形状更接近球状蛋白还是线形的葡聚糖来确定其适合哪种选择性曲线，进而决定介质类型。 在目标分子的分子量或分子形状未知的情况下

25、，一般可以先选择分级范围较宽，有着较高排阻限的介质来进行分离.,47,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第四节 实验方案设计,二、洗脱剂的选择 凝胶过滤层析中所用流动相即洗脱剂通常不对选择性产生影响，从理论上讲，如果所分离物质不带电荷，可以直接用蒸馏水进行洗脱，实际操作时，当对较大体积的样品进行脱盐实验时，也的确有用蒸馏水洗脱的例子。然而绝大多数情况下人们考虑用缓冲液而不是蒸馏水来作为洗脱剂。,48,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第四节 实验方案设计,选择缓冲液时首先要考虑的是在纯化过程中维持合适的pH，在此pH下目标分子稳定性良好。大多数凝胶过滤在中性pH附近进行，此时建议使用缓冲能力在pH68

26、的水相缓冲系统，此环境对多数生物分子及介质都是适宜的。 有的凝胶介质本身会带有少量的负电荷，这会对按分子大小分离的凝胶过滤层析结果产生影响，为了排除这种影响，洗脱剂通常需要具有一定的离子强度，通常0.15mol/L的离子强度足以排除溶质与介质之间任何的离子作用。,49,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第四节 实验方案设计,三、层析柱的选择 层析柱应当具有以下特点： （1）柱壁材料结实、化学惰性，能够承受一定的操作压力，在常规的层析条件下保持稳定，不与样品及洗脱剂发生相互作用； （2）层析柱的入口和出口部分的死体积尽可能小，低于柱体积的0.1%，这样可以使样品的稀释程度最小化，同时防止已经分离的样

27、品区带在柱下端重新混合；,50,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第四节 实验方案设计,（3）柱内有设计合理的凝胶床支持物，既能有效的支撑凝胶床，又不易被堵塞，保证液流能够均匀的通过； （4）容易拆卸，方便清洗，最好配件具有通用性。 实验室常用的凝胶过滤柱的内径大多在416mm，而柱长大多在25100cm。,51,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第四节 实验方案设计,四、选择预装柱 对于高分辨率凝胶介质，其粒度往往较细，要获得好的柱效填充技术非常重要。 为了确保此类介质的高分辨特性，很多公司将自己的部分层析介质制成预装柱后出售，由于采用了优良的材料，合理的层析柱结构设计和良好的装柱技术，这些层析柱在

28、耐用性、清洗效果、柱效等很多方面要优于自装柱。当然，其价格相对来说比零售介质更贵。,52,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术,当实验方案设计完成后，就需要着手对选择好的凝胶介质、层析柱、洗脱剂、样品等进行准备，装柱，平衡，加样，洗脱，样品检测并收集，层析柱的清洗和再生，这些方面统称为层析技术。,53,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术,一、凝胶的准备 如果介质是以已溶胀好的形式出售的，此类介质一般也无需预处理，使用前静置使介质沉降，倾去上清液，按湿胶洗脱剂（v/v）=31的比例添加洗脱剂，搅匀后即可装柱。 如果介质是以固态干胶形式出售的，在使用前需要进行溶胀。溶胀是介质

29、颗粒吸水膨胀的过程，膨胀度（得水值）与基质种类、交联度及洗脱剂种类等有关。为了填充一根选定的层析柱需要称取多少量的干胶是可以计算的： 干胶用量（g）r2h / 膨胀度（床体积ml/g干胶）,54,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术,二、装柱 填充过程 装柱质量的好坏直接影响到分离效果，填充得不好的层析柱会导致柱床内液体流动不均匀，造成区带扩散，大大影响分辨率，也会对层析流速产生影响。 装柱过程应避免在通风和日光直晒的环境中进行，以防温度改变造成层析柱内产生气泡。层析柱应在支架上垂直放置。装柱之前先用洗脱剂将层析柱底部死空间内的空气排空.,55,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节

30、层析技术,将已处理好的介质放置在烧杯中，倒掉过多的液体，大致使得沉降介质：上清液（v/v）=31。 介质太稠在装柱时容易有气泡产生，而介质太稀则很容易在柱中形成多个界面，造成很差的填充效果。 将介质悬液轻微搅拌混匀，利用玻棒引流尽可能一次性将介质倾入层析柱，注意液体应沿着柱内壁流下，防止有气泡产生.,56,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术, 填充质量的评估 装柱完成后，在进行层析之前应当对装柱情况进行检查，简单的方法是将柱子对着亮光，利用透过光检查柱床是否规整，是否有气泡或界面存在。 也可以通过对有色物质进行层析并观察区带情况来实现，观察有色区带通过凝胶床时的变化情况可以检验填充

31、效果，填充良好的凝胶柱在洗脱时区带保持均匀、平稳的向下移动。,57,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术, 柱的平衡 平衡的目的是为了确保层析柱中凝胶颗粒网孔和间隙中的液体与洗脱剂在组成、pH和离子强度等方面达到完全一致，这样在加样和洗脱过程中就能使待分离组分始终在所需的溶液环境中，有利于目标分子活性的保持和层析行为的稳定性。 人们通常采用23个床体积的洗脱剂通过层析柱来确保其完全达到平衡。,58,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术,三、样品和洗脱剂的准备 洗脱剂配制时采用的试剂应当是分析纯，而所用的水应当为纯水。洗脱剂配制完毕在使用前，最好对其进行过滤。 层析前样品如果

32、是固体，可以将其溶于一定体积的洗脱剂中，如果是液体样品，则可以直接加样。为了延长介质的使用寿命和保持高的分辨率，样品中同样必须无颗粒状物质存在。,59,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术,样品的黏度是影响上样量和分离效果的一个重要方面. 如果样品黏度过高是由于浓度造成的，用洗脱剂或水稀释样品可以达到降低黏度的目的； 如果黏度是样品中核酸等杂质引起的，可通过添加大分子聚阳离子化合物如聚乙酰亚胺或鱼精蛋白硫酸盐将其沉淀，或添加核酸内切酶来降低黏度，但这些物质无疑会成为额外的杂质。 如果样品黏度非常高的话，也可以通过往洗脱剂中添加蔗糖或葡聚糖增加洗脱剂的黏度来补偿。,60,高级教育,第五

33、章 凝胶过滤层析第五节 层析技术,四、加样 当层析柱准备好且平衡完成，样品和洗脱剂准备完毕后,就可以开始加样和洗脱了。加样过程是将一定体积的样品添加至层析柱顶端，并使其进入凝胶柱。,61,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术, 加样量的选择 在进行层析时样品的添加量主要受分辨率的限制，因为分辨率Rs与样品体积/柱体积之比有关，样品体积/柱体积的比值增大会导致分辨率下降。 对于分析型分离和难度比较大的分级分离，样品体积/柱体积之比必须很小，此时加样体积应为床体积的0.5-5%,更小的加样比例并不能进一步改善分辨率。 对于具体实验的加样量，需根据样品组成和性质，凝胶介质及想得到的分离程度

34、来确定。,62,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术, 加样方法和注意事项 加样是将一定体积的样品溶液添加至柱床的床面，依靠重力或泵提供的压力使样品进入床面的过程。在加样过程中样品溶液应尽可能均匀添加至床面，这样在柱床的横截面上样品能够均匀进入，另外要防止液流破坏床面的平整性，否则会造成区带形状变差，洗脱峰变宽，从而对分辨率产生很大影响。,63,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术,加样的方法有多种，如果采用的是成套液相层析系统，一般都提供标准的加样方法，如通过进样器或注射器等，最终利用泵将样品溶液加入柱床。 对于不带有可调接头的传统填充柱，常见的加样方法有排干法和液面下加

35、样法。,64,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术,排干法是加样前先将层析柱上口拧开，让床面之上的液体靠重力作用自然排干，当床面刚好暴露时将层析柱下端阀门关闭。阀门的关闭时机必须选择恰当，过早关闭床面上仍留有少量液体会对样品产生稀释作用，关闭过晚会导致床面变干。 用吸管将样品轻轻铺加到床面上，注意不能破坏床面的平整，以免造成区带的扭曲和倾斜，然后打开柱下端阀门，受重力作用样品溶液进入床面，当样品刚好完全进入时关闭阀门。 最后用洗脱剂充满层析柱内床面上端空间，拧紧层析柱上口，即可以用恒流泵泵入洗脱剂开始洗脱。,65,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术,五、洗脱技术 当加样完

36、毕并且样品进入层析柱后，应当立即用洗脱剂对样品进行洗脱，以防样品在层析柱中扩散。通常洗脱过程以一个恒定的流速使洗脱剂通过层析柱，而这个恒定流速由静水压或者泵来控制。 凝胶过滤层析时可采用的最大流速受到多种因素的限制，其中最为关键的因素是介质的强度，流速不能超出该介质的最大流速限制.,66,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术,采用较大流速的情况出现在组别分离和大规模制备型分离时，前者由于很容易达到所需分辨率，采用高流速可有效缩短分离时间，后者对分离速度、生产效率有着比较高的要求，而对分辨率的要求相对较低，因此这两种情况可在不超过介质最大流速和背景压的情况下尽量采用高流速。 在分析型分

37、离时对分辨率的要求较高，因此通常会采用相对较低的流速。,67,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术,六、样品的检测、收集和处理 样品进行层析时，各组分的分离情况，目标分子的洗脱情况等都反映在层析图谱中，在层析图谱中，横坐标是时间或洗脱液体积，纵坐标是检测器的读数。 根据样品中组分性质的不同，有多种不同的检测器可供选择。最常用的是紫外（UV）检测器，可以在两到三个固定的波长如280nm，254nm，214nm下测定洗脱液的吸光度.,68,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术,一般来说人们需要获得分离后的样品，因此需要收集通过层析柱的洗脱液。 对于最简单的样品分离，可以采用手工

38、收集的方法，观察到层析图谱中出现洗脱峰时开始收集，到洗脱峰结束时终止收集。 液相层析系统一般都配置了分部收集器来对样品进行收集。收集的模式可以有多种，常用的是按规定的时间或洗脱液体积进行分部收集，也可根据检测器检测到的洗脱情况，按洗脱峰进行收集。,69,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术,七、凝胶过滤介质的再生、清洗和贮存 理论上来说，在洗脱剂具有一定离子强度的情况下，样品中所有组分都应当在一个柱体积内被洗脱，当洗脱液体积超过一个柱体积时洗脱即可停止.但实验中通常会使用1.52个柱体积的洗脱剂来完成洗脱过程。 在清洗方法上，最为常规的是采用碱洗，根据介质的pH稳定范围（短程）不同，

39、用0.10.5mol/L的NaOH溶液对介质进行清洗除去污染物。,70,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第五节 层析技术,浸泡在溶液中的层析柱和介质在很少使用的情况下容易出现微生物生长的现象，尤其是葡聚糖和琼脂糖类型的凝胶介质，易于感染会分泌糖苷酶的微生物，导致基质聚合物中的糖苷键降解而破坏了介质的结构。因此，无论是层析柱还是介质，在长期不使用时，不建议浸泡在对于微生物生长来说营养丰富的缓冲液如磷酸盐缓冲液中，另外，在其浸泡的溶液中添加适当的抑菌剂是必须的。,71,高级教育,重 点,一、凝胶的准备 二、装柱 三、样品和洗脱剂的准备 四、加样 五、洗脱技术 六、样品的检测、收集和处理 七、凝胶过滤

40、介质的再生、清洗和贮存,72,高级教育,实验方案设计 在设计实验方案时，应当考虑的因素主要包括: 1.凝胶过滤介质或预装柱的选择， 2.洗脱剂的选择， 3.层析柱尺寸的控制， 4.以及层析过程中有关参数的确定。,复 习,73,高级教育,复 习,层析技术 一、凝胶的准备 二、装柱 三、样品和洗脱剂的准备 四、加样 五、洗脱技术 六、样品的检测、收集和处理 七、凝胶过滤介质的再生、清洗和贮存,74,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第六节 应用实例,凝胶过滤层析可以应用于多种情况，例如对样品进行脱盐和缓冲液交换，测定目标分子的相对分子量，测定多聚物的分子量分布，测定亲和过程的平衡常数，当然还有对样品进

41、行分析型或制备型的分离，等等。,75,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第六节 应用实例,一、脱盐 脱盐是指将盐类等小分子物质从样品中除去,从而得到仅剩大分子物质的样品溶液.与透析法相比,凝胶过滤脱盐具有样品处理量大,操作时间短,不影响生物大分子活性等突出的优点。 脱盐过程属于组别分离,目标分子和盐类等在分子大小上存在很大的差异,很容易达到所需分辨率,因此对于介质和层析柱的效率要求较低.选择合适粒度的介质，使层析过程的背景压力较低,目标分子在外水体积V0被洗脱,小分子在一个柱体积内被完全洗脱,即能达到脱盐要求。,76,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第六节 应用实例,脱盐过程的目的是为了除去样品中的

42、盐类等小分子，当然在此过程中人们不希望引入其他小分子杂质，因此脱盐时可以直接采用蒸馏水作为洗脱剂，以避免引入缓冲盐等组分。 脱盐操作既可以在很小的规模上对微量样品进行，也可以在很大规模上进行。,77,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第六节 应用实例,层析柱：85040mm i.d.，介质 Sephadex G-25，样品：O，血红 蛋白；X，NaCl。加样体积：A 10ml，B400ml。洗脱体积未对 加样体积做校正。,用凝胶过滤对大体积样品脱盐,78,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第六节 应用实例,三、相对分子质量的测定 凝胶过滤层析是常用的测定生物分子相对分子质量的方法。与其他一些分子量测定

43、方法如电泳技术相比，凝胶过滤法能够在很宽的pH、离子强度、温度范围内测定天然非变性条件下生物分子的分子量，并且测定过程较为简单，不受目标分子带电状态的限制，因而在实验室中被广泛使用。,79,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第六节 应用实例,依据公式: 凝胶过滤法测定分子量的基础是公式Kav= ab logMr 即有效分配系数Kav与溶质分子量的对数logMr之间线性关系，也就是介质的选择性曲线的线性部分。 对于特定的凝胶柱，由于外水体积和柱体积是恒定不变的，根据公式可知， Kav =（VeV0）/（VtV0） 在一定分子量范围内，洗脱体积Ve与logMr之间也存在线性关系。由于选择性曲线是呈现S

44、型的，在选择性曲线的两端，并不是理想的线性关系，因此在测定分子量时，目标分子的有效分配系数必须满足0.1 Kav0.9，这也是所选介质的工作范围。,80,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第六节 应用实例,具体做法: 利用上述线性关系，人们通过将几种已知分子量的物质加样至层析柱，分别测出洗脱体积Ve，同时计算出这些分子相应的logMr值，并以Ve对logMr作图，即得到该层析柱的分子量标准曲线。然后在相同的条件下对需要测定分子量的物质进行层析，测出其Ve值，根据标准曲线即可求出该物质的分子量。,81,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第六节 应用实例,凝胶过滤层析蛋白质分子量标准曲线,82,高级教育,

45、第五章 凝胶过滤层析第六节 应用实例,五、混合物的分级分离 分离多糖 多糖与蛋白质、脂类形成的糖蛋白、脂多糖在细胞的识别、分泌以及在蛋白质的加工和转移等方面起着不容忽视的作用。近20年来，人们进一步发现多糖在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血等方面具有重要的生物活性作用，因而糖生物学的研究逐渐成为生命科学领域研究的热点，而在多糖的分离纯化和分子量分布分析中，凝胶过滤层析的应用也被广泛地报道。,83,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第六节 应用实例,具体实例: 从医用真菌Phellinus linteus的子实体中纯化一种酸性蛋白聚糖的方法。首先通过热水抽提、过滤、有机溶剂沉淀、透析和冻干等一系列过程得到粗多糖，然后用阴离子交换层析和凝胶过滤层析结合使用纯化其中的酸性组分。,84,高级教育,第五章 凝胶过滤层析第六节 应用实例,从Phellinus linteus的子实体中提取的粗多糖中纯化酸性蛋白聚糖,DEAE-纤维素离子交换层析，横坐标为分部收集时的分部号，纵坐标O.D.值经DNS显色后 测出；对离子交换后的活性分部进行Sepharose CL-4B凝胶过滤层析，O.D.值经DNS显色 后测出。,85,高级教育,