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1、资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。一、组织总 RNA的提取相关试剂: T rizol;氯仿 ;苯酚 ;异丙醇; 75% 乙醇 ; RNase-free水相关仪器 :移液器 ( 1ml制冰机、 200; 液氮 l 、&研钵 / 生物样品研磨仪;高速离心机;100 l /50 l) ;涡旋振荡仪 ;恒温金属浴。相关耗材:解剖工具 ,冰盒 ,离心管 ,离心管架,吸头( 1ml,200 l /300 l) ,一次性手套,实验手套。实验步骤1.取 暂 养 草 鱼 , 冰上 放 置一 段 时 间 , 然后 解 剖 , 剪取 肠 道 50100mg, 放入研钵中 , 加入液氮迅速
2、研磨 , 然后加入 1ml 预冷 TRIzol 试剂 , 充分研磨至无颗粒物存在。2. 转移到离心管中 , 室温放置 5min, 使细胞充分裂解 ;3.按 1ml Trizol加入 200l 氯仿 ,盖上盖子 ,迅速充分摇匀15s,然后室温放置3min;4. 4, ,1 g 离心 15min;此时混合物分为三层 , 下层红色的苯酚氯仿层 , 中间层和上层无色水相 ; RNA 存在于无色水相中 ;5. 小心吸取上清液 , 千万不要吸取中间界面 , 否则有 DNA 污染 ; 转移至一个新的离心管 , 加入等体积的异丙醇 , 轻轻混匀 ;6.室温放置 10min; 4 , ,1 g离心 10min;
3、7.弃上清 , 加入 1ml 75%乙醇洗涤 ; 涡旋 ,悬浮沉淀 ; 4 , ,1 g资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。8.9.离心 5min;弃上清 ;能够再次用75%乙醇洗涤沉淀 ;弃上清 ; 用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇 , 注意不要吸取沉淀 ; 室温放置 5min 晾干沉淀 ; ( RNA样品不要过于干燥 , 否则极难溶解 )10. 沉淀中加入30l RNase-free水,轻弹管壁 ,使 RNA溶解。RNA质量检测相关试剂 :溴酚蓝 , TEB/TAE电泳缓冲液 ,溴乙锭 ( EB)相关仪器 : (超微量分光光度计,移液器 ( 2.5 l或 2l
4、规格 ,10l 规格 ) ,电子天平 ,电泳仪 ,电泳槽 ,凝胶成像仪 ,微波炉 ,制冰机 )相关耗材 : ( 无菌无绒纸 , 吸头 , 离心管架 , PCR管, PCR管架 , 锥形瓶 , 烧杯 , 一次性手套 , 实验手套 , 冰盒 )( 1) RNA纯度的检测 :测定其 OD260 和 OD280 的值 ,根据其 OD260/ OD280的比值 ,当其比值在 1.92.1 之间 ,说明提取的总RNA纯度比较高 ,没有蛋白质和基因组的污染。( 2) RNA 完整性的检测 :取 2lRNA, 与 2l 溴酚蓝混匀 ,用 1%的琼脂糖进行凝胶电泳, 20min后 ,在凝胶成像系统中观察效果。当
5、 28S 与 18S 条带清晰 ,且亮度比大约是2:1 时, 5S条带若隐若现 , 而且没有其它条带时 , 说明完整性不错 , 能够用于下游逆转录实验。资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。二、逆转录 ( RNA 逆转录成cDNA)相关仪器 : ( PCR 仪 / 恒温金属浴 , 移液器 ( 2.5 l 或 2l 规格 , 10l 规格 ) , 100 l 冰盒 , 制冰机 , PCR 管)根据逆转录试剂盒( TOYOBO 公司 )说明书进行 ,反应体系及条件如下 :试剂使用量 ( l)Rnase Free H2O11.75-YOligo( dT)1Total RNA(
6、 1000ng)YTotal Volume12.7565 , 5min后,立即置于冰上。试剂使用量 ( l)上一步变性后 RNA 溶液12.755 RT Buffer4dNTP Mixture( 各 10mM)2Rnase Inhibitor( 10U/ l)0.25Rever Tra Ace1Total V olume20然后放置于PCR 仪上 , 反应程序为 : 42 ,60min; 99 ,5min;16,5min 。所得 cDNA放置于 -20 保存。三、PCR反应相关仪器:(PCR仪 /恒温金属浴,移液器 ( 2.5 l或 2l规格 ,10l规格 ) , 100 l电子天平,电泳仪
7、,电泳槽,凝胶成像仪,微波炉,冰盒 ,制冰机)试剂使用量 ( l)ddH 2O6.0反转录产物1.0资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。10 PCR Buffer1.0dNTP( 10mmol/l)0.2Taq 酶 ( 1U/ l)0.4Ghrelin-F( 10 mol/l)0.4Ghrelin-R( 10 mol/l)0.4MgCl 2( 25mmol/l)0.6Total Volume10反应条件 : 95, 预变性 3min; 94变性 30s, 55退火 30s, 72 延伸 45s, 共 35 个循环 ; 72 延伸 10min。反应结束后 ,取 5l P
8、CR 产物 , 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。四、PCR产物的分离 ,回收和纯化相关试剂 :胶回收试剂盒相关仪器 : ( 紫外照胶仪 , 移液器 ( 200 l, 1ml 规格 ) , 离心机 , 恒温金属浴 , 涡旋混匀仪 , 制冰机 , 超微量分光光度计 )相关耗材 :(切胶刀片 ,吸头 ,离心管架 )PCR反应得到目的条带后,加大反应体积 ,然后根据胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收纯化。将所得DNA贮存于 -20 。五、目的片段与载体的连接相关仪器 :(恒温金属浴 ,移液器 ( 1 0 l, 2.5 l 规格 )涡旋混匀仪 ,
9、制冰机 )按照连接试剂盒(TAKARA公司 ) 说明书进行操作。pMD-18T载体1 lDNA2lddH2O2l然后加入 5l Ligation Mix, 4/16 放置过夜连接。六、转化相关仪器 :(超净工作台 ,离心机 ,恒温培养箱 ,恒温摇床 ,恒温金属浴 / 水浴锅 ,移液器 ( 1000 l, 100l, 10 l, 2.5 l 规格)涡旋混匀仪 ,制冰机 )CaCl2 法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。全过程冰上进行, 4 离心 ,无菌操作。( 1)以接种环从 -80 保存的高效转化菌种蘸取少量菌液划无抗生素平板 ,培养
10、12h;( 2) 挑取单菌落接种于1ml 无抗生素 LB 培养基中 , 37剧烈震荡培养 6h;( 3)按 1:100 接种菌液于25ml LB 液体培养基中 , 37 震荡培养1.5 2h,至 OD600 达0.4 0.6;(这一步非常关键,培养过度的菌液含有较多的” 老”细胞 ,制备成感受态细胞后其接受外援DNA的能力较低 ,从而导致转化率降低)( 4)冰上预冷10min;然后 4, 6000rpm 离心 10min;( 6)弃上清 ,将细菌沉淀重新悬浮于 25ml 预冷的 0.1M CaCl 2 中 ,冰浴 20min;( 7) 4 , 6000rpm 离心 10min,弃尽上清 ;(
11、8)以 1.25ml(菌液体积的 5%)预冷的 0.1M CaCl2 溶液重悬细菌沉淀 ,同时加入 0.3ml预冷的 100%甘油 ( 甘油终浓度达1520%) ,混匀后按每支 100l在冰上分装。 -80 保存备用。连接产物转化到感受态细胞( 1)将10 l连接产物加入100l感受态菌液中,冰上放置30min;( 2)然后放到 42水浴锅中热激 90s,再在冰上放置 3min;( 3)加入 890l LB 液体培养基 , 37 震荡培养 60min;( 4)每个培养平板中加入40lX-gal和 4 lIPTG,然后吸取资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。100l菌液
12、,均匀涂布于含Amp的LB 固体培养基平板上;( 5) 37培养箱中正放1h,待菌液被琼脂完全吸干后,倒置平板,过夜培养 16h。(培养时间不宜过长,否则有卫星菌落产生)七、菌液 PCR检测相关仪器 : ( PCR仪 / 恒温金属浴 , 涡旋混匀仪 , 移液器 ( 10 规格 , 1000 l 规格 ) , 100 l 电子天平 , 电泳仪 , 电泳槽 , 凝胶成像仪 , 微波炉 , 冰盒 , 制冰机 )在平板上挑取 1020 个白色菌落 , 加入含有 1ml Amp+LB液体培养基的 1.5ml 离心管中 , 37 震荡培养 6h。3000rpm 离心 3min 后吸掉上层 400 l 上清
13、液 , 短暂涡旋将沉淀打散 , 然后把菌液当成模板 , 按上面 PCR方法进行扩增 , 经 1%琼脂糖凝胶电泳检测是否含有目的条带。挑选扩增出正确目的条带的菌液送公司测序。附注 :主要溶液和培养基的配制1) 电泳缓冲液 10TBE: 108g Tris碱, 55g硼酸 , 20ml 0.5M的EDTA, 加入蒸馏水混匀后定容至1000ml, 调节 pH 为 8.0;2) LB 液体培养基 : 蛋白胨 10g,酵母提取物5g, NaCl 10g;加800ml 去离子水 , 用 10M NaOH调节 pH 至 7.0,定容至 1000ml,高压 ( 1.034 100000Pa) 灭菌 20min, 4 保存 ;3) LB 固体培养基 : 在 LB 液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%,高温、高压灭菌20min 后降温至5060,在无菌状态下