鲟鱼硫酸软骨素制备工艺优化.docx

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1、中国农业大学学报 ，（）： ： ：鲟鱼硫酸软骨素制备工艺优化宋居易桂 萌马长伟王 顺彭朝辉李平兰（中国农业大学 食品科学与营养工程学院 ，北 京 ；北京市水科学技术研究院 ，北 京 ；北京北水食品工业有限公司 ，北 京 ）摘 要 为制备高纯度鲟鱼硫酸软骨素 ，利 用鲟鱼头骨和脊骨为原料 ，经过硫酸软骨素提取专用酶与碱性蛋白酶 联合酶解新工艺 ，并进一步经季铵盐纯化 、乙 醇沉淀 ，制得硫酸软骨素纯品 。硫酸软骨素提取专用酶和碱性蛋白酶 提取的最佳工艺为 ：硫酸软骨素提取专用酶用量 ，酶解温度 ，酶解时间；碱性蛋白酶用 量 ， 酶解温度 ，酶 解 时 间 。 季 铵 盐 乙醇沉淀法纯化最佳工艺为

2、 ：季铵盐质量浓度 、作 用 温 度 ，作 用时间 ；乙醇沉淀体积分数为 、溶 液 为 。该工艺制得的鲟鱼头骨 、脊骨硫酸软骨素 纯品的产率分别为 、 ，纯 度分别为 、 ，蛋白含量分别为 、 。关键词 鲟鱼 ；头 骨 ；脊 骨 ；硫 酸软骨素 ；提 取 ；纯 化中图分类号 文章编号 （）文献标志码 ，（，； ，； ，） ： ， ： ， ， ， ， ；硫酸软骨素（，）是一种 天 然酸性粘多糖，具有调节机体 免疫 、抗 关节炎、抗 凝血、调脂降脂、抗 动 脉 粥 样 硬 化 以 及 神 经 元 保 护 和 修复等医药和保 健 作 用。 鲟 鱼 是 现 在 世 界 上 最收稿日期 ：基金项目：北京

3、市鲟鱼 、鲑鳟鱼创新团队项目（） 第一作者：宋居易 ，硕 士研究生 ，：通讯作者：李平兰 ，教 授 ，主要从事益生菌微生物方面的研究 ，：第 期宋居易等：鲟鱼硫酸软骨素制备工艺优化 大 、最 原始的软骨 硬 鳞 鱼 类 ，我 国 目 前 鲟 鱼 养 殖 量 已达到 万，同 时鲟 鱼 骨中富含结构 与 鲨鱼 硫酸软骨素相似的硫酸软骨素 。 因此 ，对 鲟鱼 硫 酸软骨素 的 开发和应用研究 ，不 仅 可 以 提 高 鲟 鱼 的经济价值 、延 伸 鲟 鱼 产 业 链 ，而 且 高 质 量 的 硫 酸 软骨素对提高人民 的 身 体 健 康 水 平 也 具 有 重 大 的 意义。谷安超等以匙吻鲟的 软

4、骨为原料，用 稀碱胰 蛋白酶相结合的方法提取硫酸软骨素 ；许 永安等 以史氏鲟鱼软骨为原料 ，按 碱提胰蛋白酶 酶 解 醇沉的工艺流程，进行硫酸软骨素 的碱提工艺优化 研究；刘安军 等用 稀 碱碱 性 蛋 白 酶醇 沉 提 取 硫酸软骨素；徐传屯等以养殖鲟鱼软骨为原料 ，用 稀碱盐解胰酶酶解法提取硫酸软骨素。相比较 而言，国内外对 鲟鱼硫酸软骨素纯化研究不多。 陆 钊等采用超 滤离子层析法精制猪 硫 酸 软 骨 素， 产物纯度为 ；谢 捷 等采用阳离子交换树 脂分离纯 化 猪 硫 酸 软 骨 素，与 传 统 酶 解氧 化 法 相 比，收率提高，产品质量提高，杂蛋白含 量降 低 ； 等以 魟 软

5、 骨 为 原 料 采 用 了碱性含醇水解纯化工艺 ，最 后再经超滤透析过 程，进一步纯化。虽然上述几种提取工艺相对于单纯的碱提能获 得更高的硫酸软骨素得率，而且产品质量也显著提 高，但是随着国家对环保的日益重视 ，对生产工艺便 提出新的要求，即 从此前单一加工软骨提取硫酸软 骨素转变成为软骨的综合利用 生产硫酸软骨素 和提取蛋白，而生 产工艺的改进首先体现在用酶方 面。乙醇沉淀法是分离纯 化的传统方法 ，适 合工 业化生产纯度要求不高的产品 ，但 要得到纯度较高 的产品，一般还需与其他方法联用。一般 联用的 离子交换法、柱层析法等工序 繁琐 、成 本高、样 品量 损失也大。因此，开 发一套工艺

6、简单、成 本低、环 境 污染小、得率高的 硫酸软骨素提取纯化工艺显得尤 为重要。本研究采用硫酸软骨素提取专用酶和碱性蛋白酶复合提取，季铵盐乙醇 沉淀法分离纯化来对 鲟鱼硫酸软骨素的制备工艺进行优化 ，旨 在为其工 业化生产提供理论依据。 材料与方法 材料及仪器人工养殖鲟鱼购于市场。鲨鱼硫酸软骨素（质量分数）购于北京恒元启天化工技术研究院 ；盐 酸、氢 氧化钠 （：分 析纯）购于北京化工厂 ；碱性蛋白酶购于北京奥博星 生物技术有限责任公司 ；硫 酸软骨素提取专用酶购 于诺维信（此酶含 有胶原蛋白酶 、脂肪酶和糖原酶 ， 可生物降解）；葡 萄糖醛酸购于美国 公 司；牛 血清白 蛋 白、考 马 斯

7、亮 蓝：进 口 分 装，购 于 美 国 公 司；咔 唑 （）购于北京化学 试 剂 公司。通用台式冷冻离心机 ，美国 公 司； 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 ，日 本 岛 津 公 司； 柱（）， 美国怀雅特技术公司。 主要工艺流程软骨粉硫酸软骨素提取专用酶和碱性蛋白 酶复合酶解灭酶加三氯乙酸离心去蛋 白上清液醇沉、干燥季铵 盐沉淀醇 沉膜透析冷冻干燥硫酸软骨素纯品 软骨前处理将鲟鱼 鱼头和脊柱分别放到锅中水煮 ，取 出放冷后剔除头部 、脊索软骨上残留的肌肉 、脂肪和 其他结蹄组织，切 碎 后 转 至 烧 杯 中 ，加 乙 醇 浸 泡，移 出乙醇，重 复浸泡一次。 冷冻干燥后的软 骨称重，粉

8、碎，制成头骨粉和脊骨粉备用 。 酶解将所得鲟鱼软骨粉加入硫酸软骨素提取 专用酶进行酶解，酶 解后煮沸 使 酶 失 活，之 后加入碱性蛋白酶进行酶解 ，之后煮沸 使酶 失活，过滤收集酶解液。）专用酶正交试 验。 根据单因素预试验结果， 对 因素，酶 用量 （、 和 ）， 因 素，温 度（、和 ）和 因素，时间（、 和 ）各 取个水平，采用 （）正交试验，以得率、葡萄糖 醛酸含量、蛋白含量为指标，得最佳工艺。）专用 酶碱 性 蛋 白 酶 双 酶 法。 通 过 研 究 硫 酸 软 骨素提取专用酶 碱性蛋白酶的酶解时间 （ 和 、和、和、和、和）和酶用量（ 和 、 和 、 和 、 和 、和 ）进行酶解

9、条件优化 。 醇沉经 预 试 验，研 究 醇 沉 体 积 分 数 （、和）及 其 （、 和）对样品得率 及葡萄糖醛酸含量的影响 ，确 定最 佳工艺。中 国 农 业 大 学 学 报年 第 卷 季铵盐沉淀经预试验，对 因 素，氯化 十六烷基吡啶质量 浓度（、和 ）； 因素，作用温度（、和 ）和 因 素，作 用 时 间 （、 和 ）各取个水平，采用 （）正交试验，以得率、 葡萄糖醛酸含量为指标，得季铵盐沉淀的最佳工艺。 产品分析方法葡萄糖醛 酸 含 量 采 用 硫 酸 咔 唑 法；蛋 白 质 含量采用考 马 斯 亮 兰 法；水 分含量采用干燥法； 澄清度测定用分光光度法测定 处溶液的吸 收值，小于为

10、合格；酸碱度测 定使用 法；粗 品得 率 硫酸软骨素粗 品所 用软骨粉末；纯 品 得率硫酸软骨素纯品硫酸软骨素粗品 。 凝胶色谱分析采用 多 角 度 激 光散射仪结合凝 胶 渗 透 色 谱（）分别 对鲨鱼硫酸软骨素标品 、鲟 鱼 头骨和脊骨硫酸软骨素分子量和纯度进行测定。色谱条件：紫 外可见检测器、示 差检测器、多 角 度激光光散射器；流动相为 ；进样量，；流速， ；柱温，室温。 结果与分析 专用酶酶解正交试验以硫酸软骨素的得率 、葡 萄糖醛酸含量和蛋白 质质量分数为评价指标 ，对酶用量、酶解温度和酶解 时间进行三因素三水平的正交试验 ，结果见表。表 不同提取工艺组合对硫酸软骨素质量的影响 序

11、号得 率 葡萄糖醛酸含 量 蛋白质质量分 数 由表极差 分析可知，极 差越大说明该因子 的水平对试验结果影响就越大 ，因 而不同工艺条件 对硫酸软骨素中葡萄糖醛酸含量的影响顺序为 ：酶 用量提取温度提取时间。对硫酸软骨素产品而言，葡萄糖醛酸含量高 ，产品质量优。、 分别代表各因素在各水平所对应的试验指标的平均值， 它们的大小可以判断同一因素各水平对实验指标的 影响大小，所以由 值大小确定葡萄糖醛酸含量最 高的工艺组 合 为 ，即 酶 用 量 （ ）、于 下振荡浸提 。 专用酶碱性蛋白酶双酶法专用酶碱性 蛋 白 酶 的 酶 解 时 间 组 合 试 验 结 果 见表，从中可以看出，蛋白 质含量在酶

12、组合 降到 最低，而葡萄糖醛酸含量则达到最高 。由此可见，在 专用酶和碱性蛋白酶用量一定的条件下 ，先 加专用 酶水解，后加碱性蛋白酶水解 效果较好。蛋白质含量在酶组合为 最低，而 样品得率和 葡萄糖醛酸含量在这组合中达到最高。 由此可见， 在酶解时间确定的情况下 ，采 用 专用酶和 碱性蛋白酶进行酶解效果较好 。第 期宋居易等：鲟鱼硫酸软骨素制备工艺优化 表 不同工艺组合对硫酸软骨素质量影响的极差分析 指标因素 酶用量（）温度（）时间（）（）（）（）极差极差极差葡萄糖醛酸含量 蛋白质质量分数 得率表 专用酶 碱性蛋白酶的酶解时间 、酶用量组合试验结果 项目酶名称酶质量分数 酶解时间 得 率

13、葡萄糖醛 酸 蛋白质含 量 酶解时间结果专用酶碱性蛋白酶酶解用量结果专用酶碱性蛋白酶注 ：“”前为专用酶的用量及酶解时间 ，后为碱性蛋白酶的用量及酶解时间 。： “”， 中 国 农 业 大 学 学 报年 第 卷 醇沉 乙醇沉淀浓度由图、图可以看出，产 品得率随着酒精沉淀 浓度的升 高 而 提 高，在 时 基 本 趋 于 稳 定；而葡萄糖醛酸 含量则先随着酒精沉淀浓度的升 高而增加，浓度时达到 最高，之 后却有所下降。 考虑到醇浓度增加，成本相对增加，而且酒精沉淀浓度以上得率增加极少，因 此乙醇沉淀浓度选择为宜。图 乙醇体积分数对样品得率的影响 图 乙醇体积分数对葡萄糖醛酸含量的影响 醇沉溶液的

14、 葡萄糖醛酸含量和样品得率随溶液 都呈先 上升后下 降 的 趋 势 （图 、图 ）。 在 溶 液 为 时，葡萄糖醛酸含量和产品得率都达到最高 ，故溶液 选取。图 醇沉溶液 对产品得率的影响 图 醇沉溶液 对葡萄糖醛酸质量分数的影响 季铵盐沉淀正交试验以硫酸软骨素的得率 、葡 萄糖醛酸质量分数为 评价指标，对氯化十六烷基吡啶质量浓度 、作用温度 和作用时间进行三因素三水平的正交试验 ，试 验设 计及结果见表。表 季铵盐沉淀正交试验结果 序号因素 氯化十六烷基吡啶质量浓度（）温度（）时间（）得 率 葡萄糖醛酸 质量分 数（）（）（）第 期宋居易等：鲟鱼硫酸软骨素制备工艺优化 表 （续）序号 因 素

15、 得 率葡萄糖醛酸氯化十六烷基吡啶质量浓度（）温度（）时间（）质量分 数（）（） （）由表极差 分析看出，极 差越大说明该因子 的水平对试验结果影响就越大 ，因 而不同工艺条件 对硫酸软骨素中葡萄糖醛酸含量的影响顺序为 ：季 铵盐质量浓度作用温度作用时间。对硫酸软骨素产品而言，葡 萄糖醛 酸 含 量 高，产 品 质 量 优。、 分别代表各因素在各水平所对应的试验指标 的平均值，最大的 值对应着最好的水平，所以葡萄糖醛酸含量最高的工艺组合为 ，即季铵盐 浓 度、于 下静置。表 不同工艺组合对硫酸软骨素质量影响的极差分析 因素 指标氯化十六烷基吡啶质量浓度（）温度（）（）时间（）（）（）得率极差葡

16、萄糖醛酸质量分数 极差 产品的质量通过上述工艺得到鲟鱼头骨和脊骨的粗品率分 别为、，纯品得率分别为 、，对样品鲟鱼头骨和脊骨硫酸软骨 素 纯 品 进 行 质 量 分 析，并与购买的标准品鲨鱼硫酸软骨素进行对比 ，结 果见表。中 国 农 业 大 学 学 报年 第 卷表 鲟鱼硫酸软骨素产品质量测定结果 指标鲨鱼硫酸软骨素标准指标 测定结果 头骨硫酸软骨素 脊骨硫酸软骨素 葡萄糖醛酸质量分 数 蛋白质质量分 数 含水 率 澄清度 酸碱度 凝胶色谱分析通 过 凝 胶 色 谱 图 分 析 软 件 （ ）得到鲨鱼 硫酸软骨素标品 、鲟 鱼 头 骨、脊骨硫酸软骨 素 的 纯 度 （质 量 分 数 ）分 别

17、为 、 和 ，它 们 的 分 子 质量及其分布如 表 所示。表 鲟鱼和鲨鱼硫酸软骨素的分子质量及其分布 样品平均分子质量 数均 重均 均 分子质量分布（重 均数 均） 鲨鱼硫酸软骨素 鲟鱼头骨硫酸软骨素 鲟鱼脊骨硫酸软骨素 比较 种 硫 酸 软 骨 素 的 分 子 量 发 现，数 均 与重均 都相互有显著差异（）。 鲟鱼脊 骨硫酸软骨素的 显著高于鲟鱼头骨硫酸软 骨素 和鲨鱼硫酸软 骨 素 （），鲨 鱼 硫 酸 软 骨 素 的 显 著 高 于 鲟 鱼 头 骨、脊 骨 硫 酸 软 骨 素 （ ），但鲨 鱼硫酸软骨素的 却 显著小于鲟鱼头 骨、脊 骨 硫 酸 软 骨 素 （）。 通 过 检 验 法

18、 发 现，鲟鱼头骨与脊 骨硫酸软骨素的分子量分布之间 并没有显著差异（），但 鲨鱼和鲟鱼头骨、脊骨硫酸 软 骨 素 的 分 子 量 分 布 呈 现 显 著 差 异 （ ），相应的变异系数 （）分别为（鲨鱼 ）、（鲟鱼头骨 ）和 （鲟 鱼脊骨 ），说明纯化出的鲟鱼头骨 、脊骨硫酸 软骨 素的分子量组分更为均一 、集中，纯度也更高。 结论与讨论制备鲟鱼硫酸软骨素最佳的酶解工艺条件是： 先将碳酸钠缓冲液调 ，接着加入硫酸软骨素 提 取专 用 酶 ， 保 温 水 解 ；后 升 温 至 ，加入碱性蛋白 酶 ，保 温水解 ；季 铵 盐乙醇沉淀法纯化最佳 工 艺 为 ：季 铵 盐 浓 度 、于 下静置，乙醇

19、沉淀浓度为、 为；第 期宋居易等：鲟鱼硫酸软骨素制备工艺优化 按所研究的最佳工艺条件制备鲟鱼头骨和脊骨的硫 酸软骨素，其纯品得率 分别为 、，蛋 白 质质量分数分别为 、，葡 萄 糖 醛 酸 质量 分 数 分 别 为 、，纯 度 为 、 ，与购买的 鲨鱼硫酸软骨素标准品相 比，分 子量组分更为均一、集中，纯度也更高。鲟鱼头骨与脊骨硫酸软骨素的分子量分布之间 虽然没有显著差异，但数 均 （）与 重均 （）两 者 之间具有显著差异，推测可能由于 硫酸软骨素本身 结构的 多 样 性，比 如 硫 酸 软 骨 素 、硫 酸 软 骨 素 等，还有分 别 的 含 量 多 少，故 要想确定鲟鱼头骨 和脊骨硫酸

20、软骨素中的结构成分 ，还需要进行高效 液相、核磁共振等研究，本试验对其分别进行提取纯 化得到 相 应 纯 品，为 进 一 步 研 究 其 结 构 功 能 奠 定 基础。参考文献 许永安 ，陈 守平 ，吴 靖娜 ，等 鲟 鱼 硫酸软骨素的制备工艺研究 渔 业科学进展 ，（）： ： ，（）： 谷安超 ，李 诚 ，肖 岚 ，等 匙 吻鲟 硫 酸软骨素提取及纯化工艺研 究食品研究与开发 ，（）： 许永安 ，陈 守平 ，苏 金华 ，等 史 氏 鲟鱼硫酸软骨素的提取及抗 肿瘤活性的研究上海海洋大学学报 ，（）： 刘安军 ，王 慧 ，朱 振 元 ，等 鲟 鱼 硫 酸 软 骨 素 提 取 工 艺 的 研 究现

21、 代食品科技 ，（）： 徐传屯 ，关 瑞章 ，郑 江 ，等 养 殖鲟鱼软骨中硫酸软骨素的优化 提取工艺研究中国生化药物杂志 ，（）： 陆钊 ，董 树 国 ，王 玥 ，等 超 滤离 子 层 析 法 精 制 猪 硫 酸 软 骨 素吉林农业大学学报 ，（）： 谢捷 ，罗 小芳 ，朱 兴一 ，等 离 子交换法分离纯化猪硫酸软骨素 的研究浙江工业大学学报 ，（）： ， （） ，（）： 王安 ，刘 靓 ，刘 敏 尧 ，等 硫酸软骨素提取用酶的现状及前景 食品研究与开发 ，（）： 田甲春 ，余 群力 胃 蛋白酶提取硫酸软骨素工艺优化 肉 类 研究 ，（）： 陈亚 ，徐 晓燕 响 应面法优化硫酸软骨素提取的酶解工艺 中国生化药物杂志 ， （）： 李川 ，段 振华 利 用罗非鱼头提取硫酸软骨素的工艺探讨 食品科技 ，（）： 郝淑贤 ，魏 涯 ，李 来好 ，等 鲟 鱼软骨素提取工艺研究 食 品 工业科技 ，（）： 周叶 ，赵 婷 ，冯 伟伟 ，等 咔 唑法测定中华鲟软骨中硫酸软骨素 的含量安 徽农业科学 ，（）： 户业丽 ，蔡 焕焕 ，程 波 ，等 人 工养殖鲟鱼头中硫酸软骨素的提 取工艺食品研究与开发 ，（）： ，：责任编辑：苏燕