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1、第三章_真核细胞周期调控的分子机制,1,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,2,第十九章,真核细胞周期调控的分子机制,唐旭东,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,3,2001年10月8日美国人LelandHartwell、英国人Paul Nurse、TimothyHunt因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,4,第一节,细胞周期及调控的概述,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,5,细胞周期,间期 (interphase),分裂期 (M),G1期 (合成前期) S期 (DNA合成期) G2期 (合成后期),前期 (prophase) 中期 (met
2、aphase) 后期 (anaphase) 末期 (telophase),一、细胞周期 (cell cycle),有丝分裂,(mitosis),胞质分裂(cytokinesis),第三章_真核细胞周期调控的分子机制,6,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,7,细胞周期的不同时相(phase),G0,裂殖酵母,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,8,二、细胞周期调控的主要分子机制,细胞周期引擎异二聚体蛋白激酶复合体 包括二个亚单位： 调节亚单位：细胞周期蛋白（cyclin） cyclin浓度随细胞周期不断变化 催化亚单位：细胞周期蛋白依赖性激酶 (cyclin-dependent kinase，
3、CDK) - CDK单独存在时无活性，与cyclin结合才具有激酶的活性; - cyclin不仅起激活CDK的作用，还决定了CDK何时、何处、将何种底物磷酸化。,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,9,三种控制细胞周期进程的细胞周期蛋白-CDK复合体： G1、 S期和有丝分裂-CDK复合体 （G1-CDK复合体的合成和活性的调节是细胞周期的主要调控机制） 前复制复合体（ pre-replication complex，pre-RC） ： 其磷酸化既可启动DNA的复制，又可防止新的前复制复合体组装 翻译后调节机制： 蛋白磷酸化、泛素依赖的蛋白降解,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,10,三、研
4、究细胞周期调控的实验体系,（一）细胞的DNA含量提示其所处的细胞周期时相 用与DNA结合的荧光染料处理细胞，再用流式细胞术(FCM)测定每一细胞的DNA含量。 荧光激活的细胞分选仪（FACS ) （二）细胞融合实验 （三）互补实验,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,11,Control,Drug-treated,细胞周期阻滞于S期,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,12,细胞周期阻滞于G2期,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,13,参与细胞周期调控的分子,第二节,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,14,一、细胞周期蛋白（cyclin）,种类： 目前分离出30余种 脊椎动物：A1-2、B
5、1-3 、C D1-3、E1-2、 F、G、H等 人类：A、B、C、D、E。 分类：不同时相发挥作用 G1周期蛋白：在G1期发挥作用（C D E） （S和）M期周期蛋白：A B 在G2/M调控点发挥作用,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,15,一、细胞周期蛋白（cyclin）,共同结构： 均含有一段约100150个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒（cyclin box)，是与CDK结合的关键区。 功能： 不同的cyclin识别不同的CDK，组成不同的cyclin-CDK复合物，表现出不同的CDK激酶的活性。,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,16,G1周期蛋白,表达顺序：先cyclin C
6、 D，再cyclin E cyclin D和E，为细胞通过限制点所必需 cyclin D亚类： D1 D2 D3 cyclin D CDK： 4、6 cyclin D功能：使下游蛋白磷酸化 如： CDK4/6- cyclin D使视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）蛋白磷酸化,释放转录因子E2F,促进CDK2、 cyclin E表达,进一步磷酸化Rb,阳性反馈回路,*此时细胞周期不依赖CDK4/6- cyclin D复合体的活性,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,17,细胞周期的调控,CDK1 /Cyc B,*Cyclin D 和E在G1期表达，为细胞通过限制点所必需,第三章
7、_真核细胞周期调控的分子机制,18,S和M期周期蛋白,合成顺序：A早于B （1） cyclin A： 与CDK1和CDK2形成复合物 （2）cyclin B 亚类： B1 B2 B3 合成： 在胚胎细胞周期中连续合成，但在有丝分裂后期（晚期）迅速降解。 ？ CDK：1,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,19,二、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）,种类：目前动物中发现9种，人类7种（17) 共同结构： 相似的激酶结构域，是一段保守序列，与周期蛋白的结合有关。 至少有两个结构域：T-loop、ATP结合位点 激活： Cyclin与CDK结合为CDK发挥酶活性所必需 但CDK 仅与Cyclin 结
8、合并不能使CDK激活 只有T-loop 中的Thr161残基磷酸化才能使CDK激活。,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,20,二、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）,功能： 在不同细胞时相，特定的CDK与特定的cyclin形成细胞周期特异的蛋白激酶复合体，调节细胞周期进程。 激活的CDK1可将靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应。,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,21,脊椎动物细胞CDK-细胞周期蛋白复合体,CDK 细胞周期蛋白 功能,CDK1 cyclinB1,B2,B3 有丝分裂 cyclin A G2/M CDK2 cyclin A S期 cyclin E G1/S CDK3 ？ G1/
9、S? CDK4/6 cyclinD1,D2,D3 G1期,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,22,三、泛素与APC,泛素（ubiquitin) 组成和分布： 由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素； 作用： 共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,23,把泛素加到周期蛋白或其他蛋白需要3个酶: 泛素激活酶(E1): 泛素-COS-Cys-E1(活化) 泛素结合酶(E2): 泛素-COS-Cys-E2(转硫酯） 泛素连接酶(E3): 泛素-CONH-Lys-底物蛋白(标记) 泛素与被
10、选择降解的蛋白质形成共价连接，使后者标记并被激活，称为泛素化。 蛋白酶体可迅速将泛素化的底物蛋白降解 后期促进复合体（anaphase promoting complex ，APC ）就是一种E3,可将泛素连到M期周期蛋白上,作用机制：,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,24,分裂期周期蛋白B的N端有一段序列与其降解有关，称破坏作用盒(destruction box)； APC使E2-泛素复合体找到破坏作用盒，并将泛素转移到位于盒C端的Lys残基； 泛素化-多泛素化 共价结合一串泛素的过程，称为多泛素化(polyubiquitination)。 周期蛋白B被蛋白酶体识别而降解,周期蛋白B(c
11、yclin B)如何降解？,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,25,细胞周期蛋白的破坏作用盒与降解途径,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,26,其他蛋白的降解,G1期周期蛋白也通过类似的途径降解，但其N端没有破环作用盒，C端有一段PEST序列与其降解有关。 PEST序列：指富含脯氨酸（P)、谷氨酸（E)、天冬氨酸、丝氨酸（S)和苏氨酸（T)的残基序列 缺氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor 1 ，HIF-1),第三章_真核细胞周期调控的分子机制,27,Expression and activation of HIF-1 are regulated by the
12、oxygen concentration *Under normoxic conditions: hydroxylation interaction with von Hippel-Lindau (pVHL) pVHL is an important component of the E3 ubiquitin ligase complex. ubiquitinization and degradation *Under hypoxic conditions: Inhibition of hydroxylation Suppression of degradation accumulation,
13、Hypoxia inducible factor 1 (HIF-1),第三章_真核细胞周期调控的分子机制,28,四、生长因子(growth factor),生长因子是一大类与细胞增殖有关的信号物质，目前发现的生长因子多达几十种； 多数有促进细胞增殖的功能，故又称有丝分裂原（mitogen），如表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）等； 少数具有抑制作用（或称生长抑制因子） 如抑素(chalone)、肿瘤坏死因子（TNF）、c-mos原癌基因产物、p39mos(Mos)。,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,29,生长因子的作用机理,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,30,五、周期蛋白
14、-激酶抑制因子（CDK-kinaseinhibitor，CKI）,CKI对细胞周期起负调控作用 CKI分为两大家族： INK4 (Inhibitor of kinase 4)家族 CIP / KIP 家族 CIP: CDK inhibitory protein KIP: Kinase inhibitory protein,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,31,一、INK4 家族的CKI,包括：P16(INK4a)、P15(INK4b)、P18(INK4c)、P19(INK4d) 共同结构： 4个锚（ankyrin）重复序列 CDK：识别CDK 4、6，不识别CDK 2 功能： 通过与cyc
15、lin D竞争结合CDK 4而引起细胞周期在G1期停滞,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,32,一、INK4 家族的CKI,（一） P16 功能： 结合CDK4和CDK6，抑制CDK-cyclin D复合体的催化活性 使细胞周期在G1期停滞 意义： P16的严格调节对维持细胞的正常生长是必需的 常在肿瘤和癌细胞中缺失或灭活（甲基化）,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,33,一、INK4 家族的CKI,（二） P15 诱导剂：转化生长因子（TGF-） 意义： 甲基化使P15启动子沉默在血液恶性病变中起重要作用 P15的异常甲基化对估计预后具有意义,P15和P16都具有抑制端粒酶活性和抑制细胞
16、生长的作用（具有肿瘤抑制作用）,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,34,二、 CIP / KIP 家族的CKI,包括:： P21 (CIP1/WAF1/SDI)、P27 (KIP1)、P57(kip2）等 共同结构：N端CDK抑制性功能域 功能： 抑制CDK2-细胞周期蛋白A和CDK2-细胞周期蛋白E的激酶活性。 过多表达引起G1期细胞周期蛋白停滞。 P21和P27是CDK4的激活因子。,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,35,（一）P21,结构特点：启动子上有P53结合位点 功能： DNA损伤时G1期停滞的关键性决定因素 在G2/M转折中起作用 参与细胞的终末分化和衰老 与DNA聚合酶的
17、辅助因子PCNA结合，直接抑制DNA的合成。 表达调节： P53的转录激活调节 P53-非依赖的调节：P202、STAT信号通路、癌基因产物的负性调节（c-Myc、Set、Her2）,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,36,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,37,（二）P27,表达调节： 上调信号：phosphatase and tension homolog (PTEN ) Forkhead转录因子 (Afx、Fkhr、 Fkhr-L1） 下调信号：CpG岛过度甲基化 癌蛋白（c-Myc、Her2) （三）P57 在Beckwith-Wiedeman综合征（BWS)中丢失 受IGF-II
18、的负调节,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,38,三、新的CKI-14-3-3,14-3-3家族的成员之一 与细胞分裂周期(cell division cycle，CDC)有关的基因CDC2 、CDK2和CDK4相互作用 抑制CDK活性 阻断细胞周期进展,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,39,Cell cycle主要直接依赖于一系列异二聚体蛋白激酶复合体的调节； 蛋白激酶复合体的活性依赖于各种cyclins的合成与降解； Cyclins的合成受各种生长因子影响； Cyclins的降解与泛素降解途径有关； 蛋白激酶复合体的活性还受CKI抑制。,小结,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,40
19、,第三节,细胞周期的运行,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,41,细胞周期和其他的一些细胞生理过程就像多米诺骨牌,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,42,细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclin D表达； 并与CDK4、CDK6结合而活化激酶； G1-CDK使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F； 促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK12的基因。 在G1-S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。,一、细胞周期的启动（G0G1）,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,43,生长因子促进细胞进入细胞周期,第三章_真核细胞周
20、期调控的分子机制,44,Cyclin D与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,45,二、DNA复制（ G1S ）,在G1-S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。 DNA的复制是由复制起始点（origins of replication）开始的; 复制起始点也就是自主复制序列，散布在染色体上; 在整个细胞周期中，复制起始点上结合有起始识别复合体（Origin recognition complex, ORC）;,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,46,CDC6是一个调节因子，在G1期CDC6含量瞬间提高; 细胞分裂周
21、期(cell division cycle ，CDC) 基因CDC6结合在ORC上，在ATP供能下，促进6个亚单位构成的小染色体维持蛋白（mini-chromatin maintenance protein, MCM）复合体和其他一些蛋白结合到ORC上，形成前复制复合体（pre-RC）; -MCM实际上就是DNA解螺旋酶（helicase）,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,47,起始识别复合体,起始复制点,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,48,S-CDK触发pre-RC的启动，同时阻止了DNA再次进行复制; 因为S-CDK将CDC6磷酸化，使其脱离ORC; 磷酸化的CDC6随后被SCF
22、(skpi-cullin-F-box protein ) 参与的泛素化途径降解； (SCF复合体将泛素连接到G1/S期cyclin) S-CDK还可以将某些MCM磷酸化，使其被输出细胞核; 其它一些CDK也参与阻止pre-RC的再次形成，从而保证了DNA仅复制一次 。,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,49,每条染色体在一个细胞周期仅复制一次,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,50,三、进入M期 (G2-M),在G2-M期，cyclinA、cyclinB与CDK1结合，形成 M-CDK； M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累，在胚胎细胞周期中cyclin一直在合成，其浓度决定于降
23、解的速度； 但在大多数细胞的有丝分裂周期中，cyclin的积累是因为在G2-M期M-cyclin基因转录的增强;,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,51,随着M-cyclin的积累，结合周期蛋白的M-CDK（CDK1）增加，但是没有活性; -因为抑制因子Wee1激酶将CDK1的Thr14和Tyr15磷酸化 #52 -这种机制保证了CDK-cyclin能够不断积累，然后在需要的时候突然释放。 #53.,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,52,CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Thr 161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDK activating kinase,CAK)的作用下
24、完成的,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,53,在M期，一方面Wee1的活性下降; 另一方面CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障碍; CDC25可被两种激酶激活，一是polo激酶，另一个是M-CDK本身; 激活的M-CDK还可以抑制它的抑制因子Wee1的活性，形成一个正反馈循环; 只要有少量的CDK1被CDC25或polo激酶激活，立即就会有大量的CDK被活化。,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,54,在中期当成熟促进因子 (maturation promoting factor, MPF)或称为有丝分裂和减数分裂促进因子（mitosis and meiosis promoti
25、ng factor, MPF)活性达到最高时，激活APC; APC将泛素连接在cyclinB上，导致cyclinB被蛋白酶体（proteasome）降解; 完成一个细胞周期。,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,55,Cyclin B的降解途径,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,56,第四节,细胞周期检验点与周期阻滞,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,57,细胞要分裂，必须正确复制DNA和达到一定的体积，在获得足够物质支持分裂以前，细胞不可能进行分裂; 细胞周期的运行，是在一系列称为细胞周期检验点（check point）的严格监控下进行的; 检验点的作用：当DNA受到损伤时,复制不完全或
26、纺锤体形成不正常，周期将被阻断。 检验点的组成：由感受异常事件的感受器、信号传导通路和效应器构成。,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,58,主要检验点有： G0/G1检验点:控制从静止状态的G0期进入G1期 G1/S检验点: 在哺乳动物中称限制点 (restriction point)或简称 R点，控制细胞由G1进入DNA合成期。 #17 细胞可能的3种命运： 继续增殖、暂不增殖、不增殖而分化 S期检验点：DNA复制是否完成？ G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点。相关的事件包括：DNA损伤？细胞体积足够大？ 中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都
27、会引起细胞周期中断。,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,59,主要的检验点,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,60,第五节,细胞周期与癌症,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,61,促细胞周期进展,细胞增殖、分裂,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,62,Rb、E2F与肿瘤,在哺乳动物细胞中，G1期受正性和负性调节信号的严格控制； Rb通过细胞周期依赖性的磷酸化/去磷酸化监控这些信号，决定细胞是否通过G1期检验点、是否进行分裂； Rb对细胞周期的调控是通过转录因子E2F来实现的； 至少有1/3的人类肿瘤存在Rb基因缺失或突变。,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,63,CDK4-Cycli
28、n D2 (有Kinase活性),Rb-E2F,ATP,ADP,促转录 (如myc,DNA聚合酶),Rb - P,+ E2F,Rb调节细胞周期,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,64,DNA Damage,GADD45,BAX,DNA Repair,P53与肿瘤,Cyclin D/CDK4,Apoptosis,G1/S block G2/M block,Cell Cycle Arrest,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,65,14-3-3与肿瘤,14-3-3受P53诱导，参与DNA损伤的调节，在P53非依赖的调节机制中可能起作用 功能丧失促进恶性转化 P27与肿瘤 表达下降与癌症的发生和低存活有关，是癌症进展的标志 表达下降可能与泛素介导的降解增加有关 受c-Myc的调节,第三章_真核细胞周期调控的分子机制,66,谢谢！,