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1、第二章 核酸的结构与功能,第一节 遗传物质的本质 第二节 核酸的化学组成 第三节 DNA的二级结构 第四节 DNA分子的高级结构 第五节 RNA的结构与功能 第六节 核酸的变性、复性与分子杂交,第一节 遗传物质的本质,1、 遗传物质必须具有的特性,a、贮存并表达遗传信息,b、能把信息传递给子代,c、物理和化学性质稳定,d、具有遗传变化的能力,DNA的特征,各异的碱基序列储存大量的遗 传信息,碱基互补是其复制、转 录表达遗传信息的基础,生理状态下物理、化学性质 稳定,有突变和修复能力，可稳定遗 传是生物进化的基础,一、DNA携带两类不同的遗传信息,2、 DNA携带两种遗传信息,a、编码蛋白质和R
2、NA的信息(编码tRNA、rRNA),64个三联体密码子 三个终止密码子 编码氨基酸的61个密码子由简并性、通用性,b、编码基因选择性表达的信息,* 原核生物的结构基因占Genome的比例很大,x174phage 5386bp 结构基因用去5169bp 比例达96,* 真核生物的结构基因占Genome的比例很小,哺乳动物中结构基因只占1015,其余80以上的DNA起什么作用目前还无法精确解释，但可以肯定其中大部分DNA序列是编码基因选择性表达的遗传信息,表现在： 细胞周期的不同时相中 个体发育不同阶段 不同的器官和组织 不同的外界环境下各种基因的表达与否以及量的差异,所以又称调控序列,二、 R
3、NA也可作为遗传物质,* RNA病毒 传染媒介是病毒颗粒（病毒基因组RNA、蛋白质外壳） Tobacco Mosaic Virus (TMV),* 类病毒（viroid）: 使高等植物产生疾病的传染性因子 只由RNA组成,三、 是否存在核酸以外的遗传物质,Prion (proteinaccous infections particle) 引起的风波 朊病毒蛋白质样的感染因子,羊搔痒病 (scripie),Prion 复制? 转录? 翻译?,人类库鲁（ kuru） 病,牛海绵状脑炎(疯牛病),均由传染性病原蛋白颗粒引起,统称Prion (朊病毒),第二节 核酸的化学组成,核 苷 酸 的 结 构,
4、左 边 是 电 脑 模 型 ， 右 边 是 简 化 的 表 示 法,酯键,糖苷键,嘧啶Pyrimidines,嘌呤Purines,一、 含氮碱基、核苷、核苷酸, 碱基 Nitrogenous bases, 核苷（nucleotide）,嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子,核糖是戊糖 RNA核糖核苷 DNA脱氧核糖核苷,1,9, 核苷酸（nucleotide acid）,核苷的磷酸酯 脱氧核糖核苷酸 核糖核苷酸,Deoxynucleotides,其中和、和之间是高能磷酸键,dNTP,Ribonucleotides,核糖核苷三磷酸缩写为NTP,二、DNA分子的一级结构 (DNA sequence)
5、,1、 多聚核苷酸链 主链是核糖和磷酸 侧链为碱基,由3,5磷酸二酯键连接,2、 链的方向：同一个磷酸基 的3酯键到5酯键的方向 (53),5-UCAGGCUA-3 = UCAGGCUA 默认书写顺序53,3、 DNA一级结构的特点,a、脱氧核糖是其显著特点 DNA极其稳定的根本原因,DNA在高pH值时磷酸酯键非常稳定 只是碱基存在构像的变化变化,酮式,烯醇式,酮式,烯醇式,RNA 在高pH时则稳定性很差,由于2OH导致的水解,b、磷酸呈四面体构型，脱氧核糖呈折叠的五元环，碱基是平 面的,C、主链是亲水的，侧链（碱基）是疏水的 主链的脱氧核糖的羟基能与水形成氢键，而磷酸基团在 生理条件下离解为
6、负离子 这些特点保证了多核苷酸链可形成稳定的构象,4、 一级结构的概念 指DNA分子中的核苷酸排列顺序 不同生物借此贮存遗传信息 决定DNA的二级结构和高级结构,第三节 DNA的二级结构,一、 DNA双螺旋模型的提出（double helix model）,* 依据,a、 1938. W. T. Astbury 首次用X射线分析DNA,b、 1950 Chargaff A + G / T + C = 1 A+T G + C,c、 1952 Alexander Todd 发现了核苷酸和核苷酸之间由磷酸二酯键联接,d、 1952 M.H.F.Wilkins & Rosalind Franklin
7、得到了高度定向的DNA纤维的X-射线照片 发现原子长轴存在0.34和3.4nm两种周期性,此外，之前的密度测定表明螺旋由两条多核苷酸链组成，且直径恒定（2nm)。,* 提出 1953. Watsosn & Crick,右手 B- DNA Double helix Model,* 双螺旋的主链,Phosphodiester Backbone,C-G,T-A,碱基互补, 直径20,* 双螺旋模型参数, 螺距为34（任一条链 绕轴一周所升降的距离）, 每圈有10个核苷酸 （碱基）, 有大沟和小沟 配对碱基并不充满双 螺旋空间，且碱基对 占据的空间不对称, 两个碱基之间的垂直 距离是3.4。螺旋转 角
8、是36度,Major Groove,Minor Groove,10.4 bp/turn,Twist 36, 大、小沟的差异, 大沟中碱基差异容易识别 ，往往是蛋白质因子结合特异DAN序列的位点, 小沟相对体现的信息较少,二、 影响双螺旋结构稳定性的因素,l 氢键 (Hydrogen bond 46 kc / mol),消除DNA单链上磷酸基团间的静电斥力,弱键, 可加热解链,氢键堆积, 有序排列(线性, 方向),l 磷酸酯键 (phosphoester bond 8090 kc / mol),l 0.2 mol / L Na+ 生理盐条件,强键, 需酶促解链,* 维持稳定性的因素,l 碱基堆积
9、力 (非特异性结合力),( 1 kc / mol 0.6kc / mol ) n, 范德华力（Van de waals force） (1.7A/ 嘌呤环与嘧啶环 作用半径),(0.34 nm/碱基对间距), 疏水作用力 (Hydrophobic interaction),不溶于水的非极性分子在水中相互联合, 成串结合的趋势力. 即熵 值(Entrophy)S上升-热力学上的稳定态,成为碱基间的部分堆积力,(磷酸骨架, 氨基, 酮基周围水分子间的有序排列 ),非极性分子间（嘌呤和嘧啶碱基）的相互成串结合 熵值 上升(S going up),l 磷酸基团间的静电斥力,碱基内能增加(温度), 使氢
10、键因碱基排列有序状态的破坏 而减弱,* 不稳定因素,三、双螺旋结构的基本形式, B-DNA 资料来自相对湿度为92所得到的DNA钠盐纤维, 此外人们还发现了A、C、D、E等右手双螺旋和左手双螺旋 Z构象等形式,DNA结构的多态性：几种不同的DNA双螺旋结构以及同 一种双螺旋结构内参数存在差异的现象,原因：多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键磷酸二酯键 的两个P-O键、糖苷键、戊糖环各个键,戊糖的构象,A DNA,B DNA,A,B,Z,A,B,Z,大沟宽,小沟窄,小沟窄,大沟变深,小沟宽深,大沟不存在,小沟窄而深,1、反向重复序列与二级结构 反向重复序列（inverted repeatitiv
11、e sequence or inverted repeats IR）又称回文序列（廻文）：指两段同样的核苷酸序列同时存在于一个分子中，但具有相反的方向. 有时也有不完全相同的情况, RNA和DNA中都可能存在. 此外还可有directed repeatitive sequence -正向重复序列,第四节 DNA序列的高级结构,C,反向重复序列间间隔较短或无间隔,反向重复序列间间隔较长,* 较短的回文序列可能是作为一种信号 如：限制性内切酶的识别位点 一些调控蛋白的识别位点,2、三螺旋DNA (Trible Helix DNA, T.S DNA),例如限制性内切酶 EcoR的识别位点 5GAAT
12、TC3 3CTTAAG5,（1） 发现和证实, 1953 年 Watson & Crick D.S DNA model 证明沿大沟存在多余的氢键给体与受体,潜在的专一与DNA (蛋白质)结合的能力,形成T.S DNA 可能性,这些发现促进了三螺旋DNA的研究,（2） 形成条件 第二股中间链必须是嘌呤链 第三股链至少长于八个核苷酸, 1957 Felsenfeld等 发现一股为嘌呤，另一股为嘧啶的核 苷酸双链能够形成三链 如： polyA/polyU polydA/polydT polyd (AG)/polyd(CT), 1987 年 Mirkin . S . M,证明plasmid DNA 在
13、 pH= 4.3的溶液中, 有T.S DNA的存在,三螺旋DNA的概念提出,a、 D.S. DNA + D.S.DNA,T.S. DNA + S.S. DNA,（3） 组成形式, 双链DNA的同源回文序列形成的三链DNA（镜向重复）,Mirkin (1987) pGG332 plasmid DNA,b、分子组成 PY/PU + PU (偏碱性介质中稳定) GG 、 AA 、 GA PY/PU + PY (偏酸性介质中稳定) 常见类型 GC AT,第三条链位于B-DNA的 Major groove中,H-DNA,两种异构体,T. S. DNA 的连接键,Watson bonding A T G
14、C (D. S. DNA),H+,Hoogsteen 氢键 G C+(质子化 ) (第三链 , pH 小于7),三股螺旋DNA结构特点总结,第三条单链DNA分子 位于B-DNA大沟内,与B-DNA以 Hoogsteen 键连接,poly(Py) : (Pu) : (Py)为常见类型,* 可能功能 可能与基因调控区域的功能和染色体重组有关,3、 四股螺旋DNA ( tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA ),发现,1958. Poly(G) X-ray photograph,碱基形成环状氢键连接结构,Tetrable Helix DNA,均有形成 四股螺旋DNA 的可
15、能,形成条件串联重复的鸟苷酸, 已有实验结果表明真核细胞端粒中存在四链结构,结 构 特 点,碱基之间靠 Hoogsteen 键连接,基本结构单元鸟嘌呤四联体,可能的功能,A、 稳定真核生物染色体结构,B、 保证DNA末端准确复制,C、 与DNA分子的组装有关,D、 与染色体的 meiosis & mitosis 有关,4、超螺旋（superhelix OR supercoil）,最早在SV40和多瘤病毒 中发现, 超螺旋是所有线性或环 形DNA的共有的重要特征,The supercoils of the SV40 minichromosome can be relaxed to generat
16、e a circular structure, whose loss of histones then generates supercoils in the free DNA.,（1）、 超螺旋结构的方向性,正超螺旋（positive supercoiled ）,导致左手超螺旋,以一根绳子做实验： 原来的绳子的两股以右旋方向缠绕；在绳子的一端向紧缠方向捻转，再将绳子的两端连接起来，则产生一个左旋的超螺旋以解除外加捻转的协变,负超螺旋（Negative Supercoiled ）,导致右手超螺旋,在绳子的一端向松缠方向捻转，再将绳子的两端连接起来，则产生一个右旋的超螺旋以解除外加捻转的协变,超
17、螺旋的形成总是要向着抵消初级螺旋改变的方向发展,所有生物的DNA几乎 有5%为 Negative Superhelix,（2）、超螺旋状态的描述,可用数学公式描述,Vinograd 方程式,L = T + W ( = + ),？,L 连接数（Linking number ） 双链DNA的交叉数， 不发生链断裂时，L为定值,T 盘绕数（Twisting number ） 双链DNA的缠绕数，初级螺旋圈数,W 超盘绕数（Writhing number） 直观上为双螺旋在空间的转动数,W= 负值（negative superhelix） W = 正值 ( positive superhelix）,4
18、20bp,* B-DNA是 力学上稳定 的结构 ( 10 bp/ helix),* 螺旋数改 变的结果之 一是产生超 螺旋 或是在 B_DNA中保 留一单链区 域，但须能量的功给, DNA在水溶液中, 构型偏B型状态, DNA以10.5 bp/helix为最稳定构型, 小于10.5bp/helix 向正超螺旋发展(紧缩态), 大于10.5bp/helix 向负超螺旋发展(松弛态) 天然的DNA都是负超螺旋 但一些生命活动过程中存在正超螺旋,B-DNA的变化情况：,（3）、体外可产生正超螺旋 溴化乙锭（Ethidium bromide EB） 放线菌素D,a、EB的插入只改变盘绕数T使其降低 但
19、L值不变,WLT L值不变 T值降低 W正值 产生正超螺旋,360o/helix 360o-26o/helix / 0ne of EB inserted,EB对超螺旋结构的影响,（4）、拓扑异构酶,拓扑异构体：只在连接数上有差别的同种DAN分子称为 这种DNA的拓扑异构体,拓扑异构酶（topoisomerase ）：催化DNA由一种拓扑异 构体转变成另一种拓扑异构体的酶类,拓扑异构酶的类别和特性,被切割的DNA链 1 1 2 2,对ATP的需求 否 否 是 是,依赖于DNA的ATP酶 否 否 是 是,产生负超螺旋 否 否 是 否,松弛负超螺旋 是 是 否 是,松弛正超螺旋 否 是 是 是,改变
20、超螺旋的方式,结合到一条链上形成复合物,切断一条链形成酶和蛋白的复合体,一条链穿越,重新连接,L=2,L=3,、拓扑异构酶 (topoisomerase I),结果：连接数增加一个增加一个负超,、拓扑异构酶Top II 旋转酶(gyrase) Top亚类之一 引入负超螺旋,作用于双链 涉及双链的 断裂和连接 每次使DNA的连接数改变2,、拓扑异构酶的生物学功能,b、防止细胞DNA的过度超螺旋 多种拓扑异构酶的作用严格控制体内负超螺旋 维持在5%水平 所以 一种拓扑异构酶的单向突变对细胞来说是致命的 因而一般两种拓扑异构酶的突变水平相当,a、恢复由一些细胞过程产生的超螺旋 如：复制叉前面正超的消
21、除 转录酶前正超的消除，后面负超的产生,第五节 RNA的结构与功能,Structure and Function of RNA,DNA,RNA,戊 糖,脱氧核糖 核 糖,碱 基,A G C T A G C U,磷 酸,磷 酸,磷 酸,结 构,双 链 单 链,存在部位,主要在细胞核 主要在细胞质,功 能,储存、复制和传递 与遗传信息表达 遗传信息 有关,DNA与RNA的区别,dAMP、dGMP AMP、GMP、 dCMP、dTMP CMP、UMP,核苷酸种类,RNA的种类、分布、功能,一 、信使RNA的结构与功能,内含子 (intron),* mRNA成熟过程,外显子 (exon),* mRNA
22、结构特点,1.帽：大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,尾：大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。 编码区：核苷酸残基,帽子结构,mRNA核内向胞质的转位 mRNA的稳定性维系 翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,* mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,tRNA的一级结构特点 分子量小，稀有碱基多 含 1020% 稀有碱基，如 DHU 3末端为 CCA-OH 5末端大多数为G
23、具有 TC,二、转运RNA的结构与功能,N,N二甲基鸟嘌呤,N6-异戊烯腺嘌呤,双氢尿嘧啶,4-巯尿嘧啶,稀有碱基,tRNA的二级结构 三叶草形 四臂三环: 氨基酸臂 DHU(臂)环 反密码(臂)环 额外环(可变臂) TC(臂)环,氨基酸臂,额外环,* tRNA的三级结构 倒L形,* tRNA的功能 活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,* rRNA的含量多 rRNA的结构,三、核蛋白体RNA的结构与功能,* rRNA的功能 参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。,* rRNA的种类（根据沉降系数）,真核生物 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA
24、,原核生物 5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA,核蛋白体的组成,mRNA tRNA rRNA,细胞中含量,1%5% 5%10% 80%90%,分子量,大小悬殊 分子量最小 (0.361.1) 106 7495个核苷酸,沉降系数,6S25S 4S 5.8S 18S 28S,结构特征,存在场所,胞核、质或核糖体 细胞质或核糖体 核糖体,功能作用,三种RNA分子的结构特征和功能作用,基本上呈线形，局部呈双链，形成发夹式结构。,呈三叶草形,线形，某些节段可能呈双螺旋结构。,作为合成蛋白质的模板,运输活化的氨基酸到核糖体上,为核糖体的组成成分,四 、其他小分子RNA及RNA组学,除了上述
25、三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。,snmRNAs,snmRNAs的种类 核内小RNA 核仁小RNA 胞质小RNA 催化性小RNA 小片段干涉 RNA,snmRNAs的功能 参与hnRNA和rRNA的加工和转运。,RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。,RNA组学,核 酸 的 理 化 性 质 The Physical and Chemical Charact
26、ers of Nucleic Acid,第 六 节,两性电离 紫外吸收 变性 复性 分子杂交,一两性电离,二紫外吸收,1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0,OD260的应用,目 录,三、DNA的变性(denaturation),定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。,方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、 酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其
27、它理化性质变化：,OD260增高粘度下降 比旋度下降浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,目 录,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外吸收光谱,增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。,Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(melting temperature, Tm)。其大小与G+
28、C含量成正比。,四、DNA的复性,DNA复性(renaturation)的定义 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,减色效应 DNA复性时，其溶液OD260降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,五核酸分子杂交(hybridization),DNA-DNA 杂交双链分子,不同来源的DNA分子,核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础,本章内容结束，谢谢！,