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1、MDS相关基因检测及其临床意义的研究MDS相关基因检测及其临床意义的研究毕可红,1.山东省千2.山东省医重点实验毕可红.等MI)s相关蛙fJ,I险驯技其临床艾的研究基础?临床研究j任海全!,张玉昆:.唐天华:,马庆恒!,郭桂月,王俊伟:,姜国胜佛山医院血液科.山东;齐南250014学科学院基础医学研究所血液肿瘤防治研究中心山东省医药卫生肿瘤免疫与中药免疫室.山东济南250062DetectionofMDSrelatedgeneexpressionanditssignificanceB,Kehong?RENHalquaTl!?ZHAN(;”一女”7.TAN(;Tianhua,MAQingheng
2、.)Guiyue.WAN(;J”7ru,ei:.JIANGGuosheng11.ShandongQianjoshanHospita1.JiTlaTl250014,P.R.Chinao.InstituteofBasiMedicine.ShandongArademyojMedicalS(P”(P.Ji7la7l250062,P.R.Chin”【摘要】目的:探讨骨髓增生异常综合征(myekxtysplasticsyndrome.MDS)患者发生与演变相关基因.方法:采用RP【,R方法测定WT1,Evi1,EvilMDS1和微卫星遗传不稳定性.结果:Evil和MDS1一I基因阳性表达率分别为51.9(
3、1427)和62.9(1727).其中低危组RARAs和高危组RAEBRAEP,TCMMI的Evi1基因总表达率分别占11.8(427)和37.0(1027).MDS卜Evil基因总表达率分别占25.9(727)和37.0(1027):MDS惠者wT1表达阳性率为55.6(1j27).低危组R,RAs和高危组RAEBRAFlTCMMI的wT1基因总表达率分别占11.8(427)和l().(1127);M患者微卫星遗传不稳定性检测结果表明.6例RA患者中发生Mfd27位点I()H0例.MI1例.9p21位点发生I()H1例.MI】例5例RAS中发生Mfd27位点I()H2例.M10例.9p21位
4、点发生I()H0例.M10例.低危组RARAS患者发生I()H或MI的共4例例RAEB中发生Mfd2位点I一)Ho例.VI10例.9p21位点发生I()H0侈J.MI1侈-J.7侈JRAFIr中发生Mfd27位点I()H1例.MI3例.9p21位点发生I()H0例.MI1俩J.:例CMMI中1俩JABSTRACT2OBJECTIVE:_rndetectthemechanismofpathogenesisanditstransformationofm3,elodysplasticsyndrome.METH.ODS:ExpressionsofEvilandMDSIEvi1geneswereexan
5、linedbvsemiquantativeRTPRNestRTPCRtechniquewasusedtodeteettheexpressionofWT1gene.Thelossofheteroz5,gosity(I()H)andtllemicrosatel】ireinstability(MSI)ofMfd27and9u:】poymorphicmicrosatellitemarkerswereassayedbvstandardPCRsil,erstaininganalysisinbonemarroweelIs.RESULTS:Evi1andMDS1一Evi1werenegativein6pati
6、entswithAA(aplasticanemia).TheEvi1expressionpercentwas51.8lIl14f)f!patients.whit(tIMI)SIExi1expressionpercentwas62.96.Fhetotalexpression【)(,rcentofF,ilgeneinRAEBRAEFTCMMIwashigherttnthatinRARASgroup.Otherwise.therewasnodifferenceofM1)S1E,i1geneexpressionbetweenRARASandRAEBRAEIT,(,MMIgroups.TheWT1per
7、eent】patients.with55.6WT1percent(10.npa(7entswithMDSwashigherthanthati11k527)and0(06)respectivel7.Yh(,totalofpatientswithRAEBRAEIT(,MMIwashigherthanthat(14.8)ofpatientswithRARA.The1ossoheterozygosity(I()H).themicrosatelliteinstalfility(MSI)ofMfd2and9t)21polymorphicmicrosatelliremarkersweredetectedan
8、danalysedinpatientswithMDS.Thepositivepercent()fI()HorMSIinRAEBRAEtTCMMIgroupwashigherthanthatinRARASgroup.with36.3(411)and56.5(916)respectire1v.CONCLUSIONS:Thelossofheterozygosity(I()H)andtheinicrosatelliteinstability(MSI)ofMfd27and9p21polymorphicmicrosatellitemarkers.andtheexpressionsWT1andEvi1are
9、relate,(】totbepathogenesisandtransformationofMDS.(i/11J(H(P,PrPz,Treat.2O05.12t181.17I一1378【基金项目】山东省卫生厅科技计划项目(1999(A1D(,B2)【第一作者简介】毕可红?女.山东威海人.副主任医师.主要从事血液肿瘤发病机制的研究工作.Tel:8653182918900Email:hikehong(a163.COFIINFLN介】姜国胜,男.山东潍坊人.博-2.N-究员.主要从事血液免疫学与分子生物学的N-究工作.Tel:8653182919505Email:janggsh(a:hotmail.C
10、OFII肿瘤防治杂志!【)1)j年9j兰鲞笙!:兰!】l111-兰:l!:!一一一一【中图分类号1R733.71【文献标识码】A【文章编号110091571(2005)1813740,1骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome.MDS)是一组以血细胞的质和量异常为特征的恶性克隆性造血干细胞性疾病.其特征之一是可以向白血病演变,如RARASRAEBRAET一白血病的演变过程.因此,研究MDS发生及其演变的分子机制或遗传基础.可以预测恶性演变,判断预后和进行基因调控治疗.由于位于3(t26的Evil基因.或与其上游MDS1基因形成EvilMDS1的融合基因.往往与组织细胞
11、的”幼稚化”和阻碍粒系细胞分化有关.,定位于人类染色体11p13的wT1基因在白血病的发生与发展起着重要作用,MDS较常发生的染色体异常在q,17p及18cl上往往存在微卫星结构.而微卫星结构的遗传不稳定性(MI)或杂合性丢失(LOH)与恶性转化有关.推测上述基因异常在MDS发生和演化中可能发挥重要作用.为了明确这一假说.我们选择了部分MDS患者做了三种基因异常的检测.结果分析报道如下.1材料与方法1.1标本来源选择山东省千佛山医院1999年5月2004年5月住院MDS患者28例,男18例.女10例.年龄l477岁.中位年龄42.8岁.RA6例.RAS5例,RAEB7例?RAEBT7例及CMM
12、I3例.骨髓单个核细胞分离:将34mI骨髓以PBS对倍稀释后常规Ficol1分离单个核细胞.PBS洗2遍.凋细胞数为110mI.8例正常人骨髓单个核细胞作为对照.MDS患者随访624个月.1.2Evi1和MDS1.Evi1测定1)试剂:Taq酶.脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP.s).MMLV(Gibco公司).焦磷酸二已酯(DEPC.Promega公司).异硫氰酸胍(Fluke公司).2)引物设计与合成:PCR引物设计参考文献进行.Evil引物序列为:5AGCAACGT(,GAATCAAGA,(TGCTTCAGAT:3|_A(,TGA(,T(TAA(AG(,T(,ACTG(iCCT(,一AGGT
13、.MDS1一Evil引物序列为:5一T(;GGAGAGCAGA(GT(,AAA(,(,:3一TTT(,AT(G(ATA(;TCTTCGC.3)RTPCR反应:采集患者骨髓细胞.ACD抗凝?常规分离单个核细胞.利用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA.反应体系45I内含有RNAfig?MMLV300U,2.5mmol,LdNTIs6uI.随机引物60pmoL.0.1mol/IDTT4.5I.1缓冲液(50molL-frisHC1.PH8.3,7.5molLK(1.3mol,IMgCI!),37(,反应1h.Evi1和MDS1一Evi1反应体系均为1()0I.上述逆转录cDNA10uI.Evil的循环
14、参数为94C30S.64(,60s.72C60s.3个循环:MDS1一Evil的循环参数为94C30s.60C60s.72C,60s.30个循环.取2()fI扩增产物在I.j的琼脂糖凝胶电泳.紫外灯下观察结果并照相.色谱扫描仪扫描.计算扩增产物与内参f3一actin(上游引物为5-CCCTTCCCTCCTCAGA一3.下游引物为5-TGT一(,AC(,TTTCACC(;TT(,(,A3)的比值.4)6例慢性再障患者骨髓作为对照组,测定指标与方法同上.13WT1基因的检测同上述步骤.采用异硫氰酸胍一苯酚一氯仿一步法提取细胞总RNA.一8O(,保存.cDNA合成及P(,R扩增:引物由中国医学科学院
15、细胞生物所合成.wT1上游引物为5CCCT(;ACCCTT(,(,(,TTCT一3.下游引物5一CCCGATGCCTTGCT(,T(,T(AT一3.扩增产物的长度为182bp.以fjactin作为内对照.上游引物为5.CCCTTC.,CTC.,TCAGA一-3.下游引物5,_T(JTCACCTTCACCGTTC(,AG一3.扩增长度为325bp.逆转录反应:反应体积为2()I.包含1gRNA模板?0.2mol/IdNFP.500ng随机六聚寡核苷酸引物.200mMDTT.100UMMIV逆转录酶和1缓冲液(50molLTrisHCI.pH8.3,7.5molKCI.3mol/IMgCI!).3
16、7C,孵育90min.I(,R扩增扩增体系为1O0ffI.其中10缓冲液10uI.15mn1olIMg(,l,1OI?2.mmol,/IdNTP2I.逆转录产物1g.Taq酶2U.wT1引物各50pmoI.q-actin引物为4()pmoI.反应条件为94C40s.55(40s.72(_60s.303个循环.取10ffI扩增产物.在20gI琼脂糖凝胶电泳上进行电泳(70V.50nlin).EB染色.紫外投射仪下观察结果.照相.昕用试剂均由Progega公司生产.6例再障患者骨髓细胞作为对照.1.4微卫星遗传不稳定性检测同上述步骤.采用异硫氰酸胍一苯酚一氯仿一步法提取细胞总RNA.一80C保存.
17、逆转录反应按照上述方法进行.微卫星寡核苷酸引物序列:Mfd27(DSS107)位于5q,上游引物为5一GAT(,(,A(,TTAACCCAAATA(,一3.下游引物5一(;(,ATCAACTTGAACAGCAT一3.扩增长度为135157bp.9p2l(D9S171)一1位于17p,上游引物为5一ACCCTAGCACT(ATGGTGAAGTC一3.下游引物5一A(,(;TA一失缺.生待差性定稳不睁H遗星卫微D一一M吣R】o词w烂?1376?AGTPAACCTCATCTCPGPC一3.扩增长度为159177bp.扩增体系总体积3OI,其中2PCRBuffer15I.上游引物和下游引物各1L.Ta
18、q酶0.4L.dNTP1.0L.模板DNA2I.去离子水补充至30址L.石蜡覆盖.循环参数:94C热变性5min,后按94C1rain,54IC1rain.721rain的顺序扩增32循环,72延伸5rain.PAUGE电泳按常规方法配制8聚丙烯酰胺尿素(交联度为5).1TBE/12O15OV电压预电泳30rain.取PCR产物8L,加等体积变性载样缓冲液(含95甲酰胺,5mMEDTA,0.05二甲苯青)经98变性10rain,置冰水浴10rain.混合后上样,12OV电压下电泳1.5h.DNA显色银染凝胶用银染方法,经固定,染色,显色和终止4个步骤.用GelDos1000凝胶图象分析仪扫描成
19、像及观察结果.1.5统计学方法采用?检验,P0.05为差异有统计学意义.2结果2.1MDS患者Evil和MDS1一Evi1基因测定结果27例MDS患者中有14例Evil基因表达阳性,表达率为51.85,17例MDS1Evil基因表达阳性,表达率为62.96,明显高于再障对照组(6例再障患者Evil和MDS1一Evil基因表达均为阴性),P值分别为0.0275和0.0070.RA,RAS,RAEB和RAEBT各亚型之间的Ev订和MDS1Evil基因表达率分析与比较结果表明,高危组RAEB/RAEI3一TcMMI的Evil基因表达率高于低危组RARAS.P一0.0460.分别为62.5(10/16
20、)和36.4(4/11).又分别占总阳性率37.0(10,/27)和14.8(4/27).而它们的MDS1一Evil基因表达率分别为62.5(10/16)和63.6(7/11),又分别占总阳性率的37.0(1o/27)和25.9(7/27),两组间差异无统计学意义,P:0.0840,见表1(Tab.1).2.2WT1基因表达的检测结果27例MDS患者中有15例WT1表达阳性,阳性率为55.6/0(15/27),进一步分析结果表明,高危组RAEB/RAEBT/CMML的WT1基因表达率高于低危组P,A/RAS,P一0.022,阳性率分别为75(12/16)和27.2(3/11).又分别占总阳性率
21、的44.4(12/27)和11.1(3/27).经过统计学分析,高危组WT1基因阳性表达率明显高于低危组.P一0.022,而6例再障患者WT1基因表达均为阴性.2.3微卫星遗传不稳定性检测结果6例RA患者中发生Mfd27位点LOH0例,MI1例,9P21位点发生LOH1例,M10例.5例RAS中毕可红.等MDS相关基因检测使其临床意义的研究发生Mfd27位点IOH2例.M10例.9p21位点发生IOH0例.M10例.RA/RAS患者发生IOH或MI的共4例.7例RAEB中发生Mfd27位点LOH2例,M10例,9p21位点发生LOH0例.MI1例,7例RAEBT中发生Mfd27位点IOH1例.
22、MI3例,9p21位点发生LOH0例,MI1例.2例CMML1例Mfd27位点发生LOH.RAEB/RAEBTCMMI患者发生LOH或MI的共9例.高危组RAEB/RAEBT/CMMI的微卫星遗传不稳定性阳性率高于低危组的阳性率,分别为56.5(916)和36.3(411).2.4临床随访结果经过随访624个月;发生微卫星异常变化者有46.1(6/13)发生演变,即1例RA患者转变为RAEB型,2例RAEB患者转为AMI2A,2例RAS转变为RAEBT,1例CMML转变为AML2B.而未发生微卫星异常变化者仅有14.2(2/14)发生演变.结果表明,发生微卫星遗传不稳定性的MDS患者容易发生恶
23、性演变.同时发生Evil,WT1和微卫星改变的4例患者,均发生白血病,而发生转型或白血病变的8例患者,均具有其中1项阳性.故联合检测更有利于预测恶性变.表1MDS患者Evi1和MDS1Evi1基因检测结果肿瘤防治杂志2)()王!旦笠鲞笠!塑,!:垦蔓!旦!墅里r_生乙Tab.1ExpressionofEvilandMDS1一EvilinpatientswithMDSSexSubtypeEvilEvilMDS1MRA+MRA一十FRA一+FRA一+MRA一一MRA+一FRAS+FRAS+MRAS一十MRAS一+MRAS一一MRAEB一+MRAEB十一MRAEB+MRAEB一+FRAEB+一MRA
24、EB一十FRAEB十+MRAEBT十一FRAEBT一十MRAEB-T+一FRAEB-T+FRAEBT+MRAET+十FRAEBT+M【,MML一一M(,MML一一Evil1actin0.56O()O1.O20.870.5600O2.101.470.95(J1.441.08f】2.3j0.760.540.49l_63OEvilMDS1-actin00.330.270.52000.6l1.230.780.3400.2201.750.8301.291.0300.4500.260.431.780.j20O3讨论MDS是一组恶性克隆性造血干细胞疾病.多数最后发生恶性演变或发生白血病.尽管国内外学者在这种
25、转换的分子调控机制方面.进行了较多相关基因的研究.但是至今没有形成肯定性结论.故需要深入分析与检测可能的相关异常基因或基因表达异常.以期发现发病或恶性演变环节.Evi1(ecotropicvirklsintegrationsite-1)基因定位于染色体36.其表达与组织细胞的”幼稚化”有关.它可抑制粒系细胞对集落刺激因子的反应.阻碍粒系细胞分化或成熟,并能抑制GA一1诱导的基因转录.阻碍红细胞生成素诱导的红系祖细胞分化障碍一.动物实验又证明在小鼠逆转录病毒诱发的急性髓系白血病(AML)模型中,Evil基因是病毒常见的插入位点,与白血病的发生密切相关.另一方面,位于Evil上游170400kb处
26、.存在MDS1基因,通过变性剪接,MDS1和Evil形成kIDS1一Evil融合基因,并参与细胞分化调节作用.而kIDS是一组克隆性疾病,大部分是白血病前期发病的本质是恶性克隆的形成,异常幼稚细胞的产生和分化障碍.因此,检测MDS患者Evil和MDS1一Evil基因表达,将有利于揭示该类患者造血细胞分化障碍和恶性变的机制.研究结果表明27例MDS患者中有14例Evil基因表达阳性.表达率为51.85.经检验,其明显高于再障对照组,P<o.05.27例MDS患者中有17例MDS1Evil基因表达阳性,表达率为62.96,亦明显高于再障对照绍.P%0.05.RA,RAS,RAEB和RET各亚
27、型之间的Evil和MDS1一Evil基因表达率分析与比较结果表明,RAEB+RAET两亚型的Evil基因表达率高于RA+RAS两亚型.P%0.05.而它们的MDS1一Evil基因表达率差别无统计学意义,P>O.05.提示Evil基因与MDS患者的病情进展有关.进一步的动态随访观察,更有利于揭示Evil和MDS1一Evil基因在MDS演变中的作用.但随后发生恶性演变的7例患者(2例RARAEB.1例RAS-AML,3例RAEBAML.1例RAETCMML)未发现Evil和MDS1一Evil阴阳性的明显转化,只有Evil相对表达量的增加.对于遗传性肾胚胎肿瘤(Wilms.turnout)的分
28、子生物学研究导致了wT1基因的发现.wT1基因定位于人类染色体11p13,编码的蛋白质为一转录因子.在随后的研究中.许多学者发现wT1基因表达于白血病之中,并与白血病的发生与发展有关.如wT1基因在未成熟的白血病细胞中呈现高表达.随细胞的分化成熟而逐渐降低.趋于成熟的正常造血细胞很少表达或不表达.而MDS具有类型的演变性,最终多数发展为白血病.故理论上应该有wT1基因表达的变化.Tamaki等.研究了wT1mRNA定量表达水平与MDS转化白血病的关系.采用RTPCR方法.以K562细胞中wT1mRNA表达水平为1.0.骨髓细胞和外周血细胞中WTlmRNA表达水平随着RA经过RAEBRAEBT向
29、AML转化呈明显增加趋势.进一步比较6个月内转白组与非转白组的wT1mRNA表达水平.发现转白组外周血的wT1mRNA表达高于非转白组.但是国内关于MDS患者wT1基因表达少见报道.我们针对性的进行了相关的探讨.结果表明约55.6的MDS患者有wT1基因表达.并且高危组RAEBRAET/CMM1的Evi1基因表达率高于低危组RA/RAS的阳性率,P<0.05.结果初步提示,wT1基因表达与MDS的恶性变有关.继续扩大病例数和测定postMDSAMI的wT1基因表达,将更有利于证实wT1基因表达在MDS恶性演变中的作用.近年来随着分子生物学技术的飞速发展,已经认识到癌基因及癌抑制基因的异常
30、改变在人类恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用.尤其是癌抑制基因功能丧失越来越受到人们的重视.自1981年Miesfeld等发现微卫星DNA不稳定性以来,人们相继在很多肿瘤中发现了杂合性丢失(LOH)和微卫星不稳定性(MSI).微卫星不稳定性(MSI)的异常改变揭示基因组不稳定性,反应了DNA修复系统基因异常.利用2045780nHI三”弓微卫星标记位点进行染色体杂合性丢失(LOH)分析技术.已经成为癌抑制基因重要的筛选手段之一”.而以PCR方法为基础的微卫星序列改变一I()H及MI测定是继点杂交,RFIP,PCRSSCP之后研究DNA遗传信息改变的又一新方法.借助于这些简单重复序列检测.可以大大
31、方便对疾病相关基因的定位以及相关遗传不稳定性的分子病理机制研究.尤其在查找抑癌基因及癌变早期诊断方面.发挥着越来越重要作用.由于MDS患者常见染色体核型异常是5(1,17P和18q.三种染色体上均具有微卫星序列.而微卫星往往可以发生杂合性丢失(I()H)和微卫星不稳定性(MI).我们选择部分MDS患者进行了q,17p上的Mfd27(D5S107),9p21(D9S171)微卫星检测.结果发现低危组RA/RAs患者发生LOH或MI的共4例.高危组RAEBRAEBTCMMI患者发生I()H或MI的共9例.高危组RAEB/RAEBT/CMMI的微卫星遗传不稳定性阳性率高于低危组的阳性率.结果提示MD
32、S患者恶性演变与微卫星遗传不稳定性有关.为了进一步明确上述三种基因异常与MDS患者演化的关系.对于MDS患者进行了624个月的随访观察.发现微卫星异常变化者有46.1(613)发生演变.即1例RA患者转变为RAEB型.2例RAEB患者转为AMI2A.2例RAS转变为RAEBT.1例CMML转变为AMI2B.而未发生微卫星异常变化者仅有14.2(2/14)发生演变.结果表明发生微卫星遗传不稳定性的MDS患者容易发生恶性演变.同时发生Evi1,wT1和微卫星改变的4例患者.均发生白血病,而发生转型或白血病变的8例患者.均具有其中1项阳性.故联合检测更有利于预测恶性变.毕可红.等M1)S相关基卡盒测丛童墨盟窭【参考文献】收稿日期:20050310修回日期:?o(1jO530(编辑:王兴武)1王嵘.骨髓增生异常综合征发病机制与治疗研究进展:J:.目外