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1、蟾蜍骨骼肌兴奋与收缩实验【摘要】：目的：研究不同刺激强度/频率对肌肉收缩的影响，探究神经-肌肉接头兴奋传递和骨骼肌兴奋的电变化与收缩之间的时间关系和特点。方法：制备蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本，利用RM6240多道生理信号采集处理系统和张力换能器，记录不同刺激强度、刺激频率对肌肉收缩张力的影响，以及不同波间隔对神经、肌膜动作电位和肌肉收缩张力的影响。结果：在逐步增加刺激强度时，骨骼肌收缩的阈刺激和最大刺激强度分别是0.4630.286V和0.6110.389V，对应的肌张力是1.1720.958g和9.9087.816g。改变刺激频率时，产生完全强直收缩的频率是18.23.9Hz，对应的骨骼肌收缩
2、张力分别是41.7628.01g。用甘油任氏液处理后肌肉张力逐渐减弱至消失。结论：当刺激强度在阈强度与最大刺激强度范围内时，随着刺激强度的增加，骨骼肌收缩的幅度也是增大。随着刺激频率的增加，骨骼肌的反应依次为单收缩、不完全强直收缩和完全强直收缩，骨骼肌收缩的幅度也是增大。同步触发双刺激不同波间隔引起收缩强度不同。甘油任氏液使肌肉失去收缩活力，但依旧有电位产生。【关键词】：蟾蜍坐骨神经-腓肠肌 电刺激 刺激强度 刺激频率 收缩张力1.引言骨骼肌的收缩功能对人体正常生命活动具有重要意义，其主要作用是保持身体姿势和产生随意运动，另外还参与呼吸、咀嚼、吞咽、语言活动及产热等。骨骼肌属于随意肌，在中枢神
3、经控制下接受躯体运动神经的支配，神经纤维传出神经冲动，经神经-肌接头把兴奋传递给骨骼肌，引起骨骼肌的兴奋，最终通过兴奋-收缩耦联机制引起骨骼肌的收缩1。 本实验通过研究蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本，观察及测量不同刺激强度、频率下腓肠肌张力变化，不同波间隔下神经干电位、肌细胞电位、腓肠肌张力各自变化及其相互联系，探究神经-肌接头的兴奋传递特性和骨骼肌兴奋-收缩耦联的电生理特点。2.实验材料2.1 实验对象：蟾蜍（Toad）一只 （浙江大学动物实验中心提供）2.2 实验仪器：RM6420BD型多通道生理信号采集处理系统（成都仪器厂）肌肉张力换能器JZJ01型（成都仪器厂）神经-肌肉标本盒探针、玻璃分针
4、、锌铜弓、手术剪刀2.3 实验药品和试剂：任氏液、甘油高渗任氏液3. 实验方法3.1 蟾蜍离体坐骨神经-腓肠肌标本制备双毁髓法处死蟾蜍，针尖刺入颅腔毁脑时，针的倾斜角度必须很小剥离出腓肠肌，然后按常规操作制备蛙和蟾蜍离体坐骨神经腓肠肌标本，制备好的标本放置在盛有任氏液的培养皿中。3.2 实验系统连接将坐骨神经腓肠肌标本固定在肌槽上，并将坐骨神经搭在刺激电极上，刺激的输出线与肌槽刺激电极连接。将张力换能器用双凹夹固定于铁支台上，其换能器的输出线插入计算机的信号输人插口将腓肠肌跟腱结扎线的一端与张力换能器的簧片相连，调节好扎线的张力，不可过松或过紧，此连线应与桌面垂直(保证肌肉一旦收缩，即可牵动张
5、力传感器的应变梁)，启动RM6240系统软件，调节微距调节器，将前负荷调至1.82.2g。3.3 刺激强度对骨骼肌收缩的影响刺激方式单次，刺激幅度0.10.3V可调，刺激波宽0.1ms.开始记录，点击“刺激”按钮，刺激强度从0.1V逐渐增大，强度增量0.020.05V，连续记录肌肉收缩曲线,记录阈刺激和最大刺激值并测量每一刺激强度所对应的肌肉收缩张力3.4刺激频率对骨骼肌收缩的影响刺激频率按1Hz、2 Hz、3 Hz、4 Hz、5 Hz、30 Hz逐渐增加（或刺激间隔逐渐减小），连续记录不同频率时的肌肉收缩曲线，观察不同频率时的肌肉收缩形态和张力变化。RM6240系统在记录结束后，在通道左侧的
6、“处理”下拉菜单中选择“刺激参数标注”，可显示刺激频率。观察各刺激频率所对应的肌肉收缩最大张力。3.5 坐骨神经干不应期的测定 测定神经干动作电位、骨骼肌动作电位，肌肉收缩的同步关系及骨骼肌的不应期：保持刺激强度（最大刺激强度），刺激持续时间（0.1 ms），刺激频率（20ms）一定，采用双刺激，测量不同波间隔下三者的收缩曲线（波间隔分别为0.5 ms，2 ms，10 ms），记录收缩曲线和相应的骨骼肌收缩张力大小。3.6 观察甘油高渗任氏液处理对骨骼肌收缩的影响 用浸润20%-30%甘油高渗任氏液的棉花包裹腓肠肌，每隔30 s 用单刺激刺激标本一次，记录出现动作电位而腓肠肌不收缩的时间。3.
7、7统计处理 结果以XS表示，Students t-test检验与方差分析。4.实验结果4.1 用锌铜弓刺激：刺激神经时腓肠肌收缩，刺激肌肉时腓肠肌收缩。4.2 不同刺激强度刺激坐骨神经对腓肠肌收缩张力的影响：数据记录见下表 阈刺激最大刺激 样本强度（V）收缩张力（g）强度（V）收缩张力（g）10.220 1.629 0.280 13.211 20.210 2.050 0.270 21.930 30.650 0.500 1.200 8.700 40.600 0.916 0.750 1.924 50.250 3.310 0.310 22.240 60.260 0.586 0.340 2.530 7
8、0.520 0.147 0.640 2.140 80.290 1.430 0.600 14.840 90.260 0.458 0.370 7.180 101.100 0.696 1.350 4.380 average0.436 1.172 0.611 9.908 SD0.286 0.958 0.389 7.816 下图为一次强度刺激实验的记录波形（纵坐标收缩张力与横坐标刺激强度）可见骨骼肌收缩的阈刺激和最大刺激强度分别是0.4630.286V和0.6110.389V，对应的肌张力是1.1720.958g和9.9087.816g。两者进行t检验，有显性差异（p0.05)，说明阈刺激强度时的肌肉收
9、缩力显著低于最大刺激强度时的肌肉收缩力。当刺激小于阈值时，骨骼肌没有收缩，在阈刺激与最大刺激强度之间，腓肠肌的收缩力随着刺激强度的增大而增大大，刺激强度大于最大刺激强度，腓肠肌的收缩力不再增大。4.3 不同频率刺激刺激坐骨神经对腓肠肌收缩张力的影响：数据记录见下表 单收缩不完全强直收缩完全强直收缩 样本频率(Hz)张力(g)频率(Hz)张力(g)频率(Hz)张力(g)1110.26 5 19.60 20.0 48.542122.16 5 27.47 22.0 96.17316.78 5 12.64 15.0 41.22411.45 5 1.91 12.0 6.125121.16 5 27.28
10、 19.0 75.49611.98 5 4.76 21.0 32.98710.19 5 0.73 19.0 4.408116.08 5 24.69 17.0 34.22917.14 5 10.08 24.0 46.351013.85 5 8.79 13.0 32.06average19.10 5 13.79 18.2 41.76SD08.11 0 10.30 3.9 28.01下图为一次频率刺激实验的记录波形（纵坐标收缩张力，横坐标刺激频率）刺激频率为1Hz时刺激频率肌肉表现为单收缩，5Hz时表现为不完全强直收缩，最低频率为18.23.9Hz。不完全强直最大收缩力和完全强直最大收缩力显著高于单
11、收缩的最大收缩力（p10.05；p20.05）。由此可见在逐渐增加刺激频率时，收缩形式依次出现单收缩、不完全强直收缩和完全强直收缩，随着频率刺激的逐渐增大，腓肠肌的收缩力不断增加，到完全强直收缩后，再增加刺激频率，腓肠肌的收缩力增大趋缓直至不再变化。4.4 不同刺激波间隔对肌肉收缩的影响：数据记录见下表双刺激波间隔 样本0. 5ms2ms10ms10.59 8.28 13.92 210.22 13.63 22.20 34.07 4.09 12.62 40.90 2.78 3.68 513.90 15.40 32.80 61.08 5.59 5.31 74.21 9.81 9.89 83.04
12、8.57 8.87 99.64 7.91 11.28 102.93 11.10 11.91 average5.06 8.72 13.25 SD4.59 3.99 8.52 以下三图分别为一次试验中记录下的间隔分别为0.5ms,2ms,10ms时的波形刺激间隔为0.5ms肌收缩张力5.0613.73g，2ms肌收缩张力8.7222.9g，10ms肌收缩张力13.2535.37g。实验得出不同波间隔的神经干动作电位与肌膜动作电位曲线有所不同。4.5 甘油高渗任氏液处理对骨骼肌收缩的影响：用甘油高渗任氏液处理后的骨骼肌收缩张力逐渐减小至消失，而肌电位和神经电位依旧存在。以下两图是一次实验中用甘油高渗
13、任氏液处理后一分钟和4.5分钟后的波形记录。可见在处理后一分钟时仍有一定张力存在，而4.5分钟时则基本消失。而肌电位和神经电位依旧存在。5.讨论：5.1 阈刺激与最大刺激：腓肠肌大多数是快颤搐型肌纤维1 ，支配腓肠肌收缩的神经是A纤维， A纤维的直径有很大差异，其阈值也有较大差异1，2。单干恒定时间的方波电压刺激坐骨神经干，电压低于阈值的强度刺激，坐骨神经干支配腓肠肌的神经纤维不发生兴奋，其所支配的肌细胞也不会发生兴奋和收缩。刺激电压达到阈强度时，坐骨神经干中阈值最低的神经开始兴奋，其所支配的运动单位的肌纤维兴奋并发生收缩，刺激强度逐渐增大，坐骨神经干中兴奋的神经纤维增加，兴奋和收缩的运动单位
14、增加，其所募集的收缩张力也增加。刺激电压达到使支配腓肠肌的A纤维全部兴奋，腓肠肌全部的运动单位增加都兴奋并收缩，收缩张力达单收缩最大值。5.2 单收缩、不完全强直收缩、完全强直收缩：以最大刺激电压的连续脉冲刺激坐骨神经干，剌激波的间隔时间大于单收缩的持续时间，肌肉收缩波呈现与刺激频率相同的单收缩波；刺激波间隔小于单收缩的持续时间，肌肉收缩波发生融合(总和），融合发生于舒张期，出现不完全强直收缩；融合发生于收缩期，出现完全强直收缩波，但神经干动作电位不发生融合。 随着刺激波间隔的减小，腓肠肌收缩张力也逐渐增大，强直收缩产生的张力显著大于单收缩。肌肉单收缩时，胞浆内Ca2+浓度升高的持续时间太短，
15、被激活的收缩蛋白尚未产生最大张力时，胞浆Ca2+浓度即已开始下降，单收缩产生的张力不能达到胞浆内Ca2+浓度相应的最大张力。强直收缩时，肌细胞连续兴奋，引起终池中的钙连续释放胞浆内的Ca2+浓度持续升高，使肌肉未完全舒张或未舒张时进一步收缩，使收缩张力逐渐增大，完全强直收缩时收缩张力达到了一个稳定的最大值3。5.3 不应期：刺激波间隔小于0.5ms时，神经干的第2个动作电位消失，肌肉的收缩显著降低。刺激波间隔小于神经干不应期，第二个刺激落在神经干的绝对不应期内，神经纤维不发生兴奋。5.4 甘油高渗任氏液：甘油可选择性地破坏肌细胞的T管结构而阻断兴奋-收缩偶联过程，甘油选择性地破坏肌细胞的T管结构后，阻断兴奋-收缩偶联过程，应只能记录到肌电，而不发生肌肉收缩反应。【参考文献】：1D . J.AIDLEY.可兴奋细胞的生理.学科学出版社. 北京.1983.9第1版. P275、 P612Mary A.B.勃雷兹尔.神经系统的电活动.科学出版社.北京.1984第1版. P453姚泰.生理学.人民卫生出版社.北京.2002.4第1版.P62