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1、题 目：无菌检查操作规程共 5 页 第 1 页文件编码：SX-09-SOP04-151-04起草人： 日期： 年 月 日颁发部门：质量管理部审核人： 日期： 年 月 日制定原因： 新订 修订批准人： 日期： 年 月 日分发部门：质量管理部、质检中心 执行日期：2009年07月01日无菌检查操作规程1 目的：建立无菌检查的基本操作规程，为无菌检查人员提供正确的操作规程。2 依据：中华人民共和国药典2010年版二部。3 适用范围：本规程适用于质检中心无菌检查的操作。4 有关责任：质检中心无菌检查人员对本规程的实施负责。5 规程内容：5.1 定义：无菌检查法：系指检查药品、敷料、缝分线、无菌器具及适
2、用于药典要求无菌检查的其它品种是否无菌的一种方法。5.2 无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置，局部洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温控（252）及除湿装置，操作室或工作台应保持正压。5.2.1 无菌室的清洁与消毒应符合QC洁净室清洁、消毒程序。5.2.2 无菌室无菌程度的检查应符合规定：见沉降菌测试规程、悬浮粒子测试规程5.3 实验设备及用具：5.3.1 电热干燥箱、电热手提式压力蒸汽灭菌器、电热恒温培养箱、试管、注射器、针头、试管架、刻度吸管、手术剪、手术镊、砂轮、注射器盒、搪瓷托盘、双碟、75%酒精棉球、无菌工作服（衣、裤、帽、口罩等）。5.3.2 微孔滤膜：直径50mm
3、、孔径0.45m，应符合规定。5.3.3 除菌滤器：除菌滤器采用的是HTY-2000型全封闭式薄膜过滤器。5.3.4 所有进入无菌室的物品必须经过消毒或灭菌，应严格按照进入QC无菌室物品清洁、消毒、灭菌规程进行操作。题 目无菌检查操作规程共 5 页 第 2 页文件编码SX-09-SOP04-151-045.4 稀释剂：灭菌注射用水。5.5 培养基：5.5.1 硫乙醇酸盐流体培养基；改良马丁培养基。5.5.2 培养基的配制、使用、管理及灵敏度检查应按照培养基管理规程、培养基灵敏度检查规程、培养基配制规程进行操作。5.6 对照用菌液：5.6.1 菌种 金黄色葡萄球菌（Staphyoccus sur
4、eus）CMCC（B）26 003、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B）10 104、枯草芽胞菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63 501、生孢梭菌（Clostridum sporgenes）CMCC（B）64 941、白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F）98 001、黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98 003。5.6.2 菌液制备 5.6.2.1 金黄色葡萄球菌（Staphyoccus sureus）菌液：取金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003的新鲜培养物，接种至营养肉汤培养基
5、中或营养琼脂培养基中，在3035培养1824小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含菌数小于100个菌。 5.6.2.2 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌液：取铜绿假单胞菌CMCC（B）10 104的新鲜培养物，接种至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基中，在3035培养1824小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1ml中含菌数小于100个菌。5.6.2.3枯草芽胞菌（Bacillus subtilis）菌液：取枯草芽胞菌CMCC（B）63 501新鲜培养物，接种至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基中，在3035培养1824小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀
6、释至1ml中含菌数小于100个菌。5.6.2.4 生孢梭菌（Clostridum sporgenes）菌液：取生孢梭菌CMCC（B）64 941的新鲜培养物，接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，在3035培养1824小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1ml中含菌数小于100个菌。，题 目无菌检查操作规程共 5 页 第 3 页文件编码SX-09-SOP04-151-045.6.2.5 白色念珠菌（Candida albicans）菌液：取白色念珠菌CMCC（F）98 001的新鲜培养物，接种至改良马丁或改良马丁琼脂培养基中，在2328培养2448小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含菌
7、数小于100个菌。5.6.2.6黑曲霉（Aspergillus niger）菌液：取黑曲霉CMCC（F）98 003的培养物，接种至改良马丁或改良马丁琼脂培养基中，在2328培养57天后， 加入35ml含0.05聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,然后,采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml中含孢子数小于100个菌的孢子悬液.5.7 操作法：5.7.1 供试品、培养基在移入缓冲间之前应先编号，并用75%酒精棉球擦拭瓶（管）外壁，然后连同其它用具（包括无菌衣、帽、口罩等）移入缓冲间，打开无菌间紫外光灯和空气过滤装置开关，
8、并使其工作在30分钟以上。5.7.2 将所需物品移入无菌室，每次试验中所用物品，必须计划好，并有备用物。操作人员进入无菌室应严格遵守质检中心洁净室进出规程。5.7.3 供试品外部消毒：5.7.3.1 橡皮塞 、铝盖、压封小瓶：先用75%酒精棉球擦拭外壁及瓶塞，待干，用消毒镊子剔去铝盖上的铝质小圆片，用酒精棉球擦拭瓶盖及橡皮塞，并将酒精棉球盖于橡皮塞上待取供试品。5.7.3.2 安瓿：先用酒精棉球将安瓿外部擦拭消毒待干，用砂轮轻轻割安瓿颈部，便于折开安瓿.取供试品时将安瓿环颈部过火焰数秒.5.7.4 无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。5.7.5 直接接种
9、法：5.7.5.1 本法适用于供试品性状不允许使用薄膜过滤法的产品。题 目无菌检查操作规程共 5 页 第 4 页文件编码SX-09-SOP04-151-045.7.6.2 吸取规定接种量的供试品溶液，以右手半握拳，小指为主，拔开培养基管的塞子，沿着培养基管壁分别接种于硫乙醇酸盐流体培养基8管，其中1管于操作结束后移到接种室接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml作阳性对照。5.7.6.3 另接种于改良马丁培养基4管。5.7.6.4取改良马丁培养基1管，同法操作加入相应的稀释剂，作阴性对照。5.7.6.5 轻轻摇动，使供试品与培养基混合。5.7.6.6 硫乙醇酸盐流体培养基管置培养箱中3035培养14
10、日，改良马丁培养基管置培养箱中2328培养14日。5.7.6.7 在培养期间，应逐日观察并记录是否有菌生长。5.7.6.8 阳性对照管在24小时内应有菌生长。5.7.6.9 如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上继续培养，细菌培养3日，真菌培养5日观察是否再出现浑浊或斜面有无细菌生长。5.7.7 薄膜过滤法：5.7.7.1 本法适用于供试品性状允许采取本法的产品。5.7.7.2 按集菌使用规程安装好集菌仪。5.7.7.3 取供试品擦拭消毒后，除去塑料盖，插好导管，进行抽滤，滤液从排液管排出。5.7.7.
11、4 取相应冲洗液冲洗后将硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基抽到全封闭式集菌培养器中。5.7.7.5 取相应的冲洗液,将相同培养基同法操作作阴性对照。5.7.7.6 阳性对照管应根据供试品特性在接种橱内加入相应对照菌液1ml。（无抑菌作用及抗革兰阳性菌以金黄色葡萄球菌为对照菌，抗厌氧菌药物以生孢梭菌为对照菌，抗革兰阴性菌以大肠埃希菌为对照菌,抗真菌以白色念珠菌为对照菌）。5.7.7.7硫乙醇酸盐流体培养基管置3035培养箱中，改良马丁培养基管题 目无菌检查操作规程共 5 页 第 5 页文件编码SX-09-SOP04-151-04置2328培养箱中各培养14日；阳性对照管培养4872小时应生长良好.5.8 结果判断：当阳性管显浑浊并确有菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得的结果判定：如硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基管均为澄清或虽显浑浊，但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格。如硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基管中任何1管显浑浊并确证有菌生长，应重新2倍量取样，分别依法复试，除阳性对照管外，其它各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。