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1、紫苏、亚麻籽油粕中迷迭香酸的闪式提取(STE)与HPLC测定唐伟卓1，赵余庆1*(沈阳药科大学中药学院辽宁 沈阳 110016)摘要：目的：利用新型的闪式技术优选提取工艺，首次建立一种从紫苏、亚麻籽油粕中检测迷迭香酸的方法。方法：采用正交设计法；测定迷迭香酸的色谱条件为：色谱柱：Kromasil ODS 色谱柱(200 mm 4.6 mm , 5m ,)；流动相：甲醇(B)-水(A,含体积分数为0.1%的磷酸)进行梯度洗脱(010min 40%B、1025min 45%B)；流速1.0mlmin-1 ,柱温30；检测波长330nm,进样量10l。结果：闪式提取(STE)的最佳工艺为：料液比1:
2、10、提取2次，每次2min、提取功率150v；迭香酸含量在5150gml-1浓度内线性关系良好，r=0.9991, 紫苏、亚麻籽油粕中迷迭香酸含量分别为3.570mgg-1, 0.01270mgg-1。结论：优选的闪式提取(STE)工艺具有提取时间短、提取效率高和防止热敏物质破坏等特点。HPLC法可用于紫苏、亚麻籽油粕中迷迭香酸的快速检测。关键词：紫苏、亚麻籽油粕；迷迭香酸；闪式提取；HPLC法 Assaying of Rosmarinic acid in perilla cake and linseed cake and the study of Smashing Tissue Extra
3、ction Weizhuo Tang1, Yuqing Zhao1( Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Liaoning, 110006, China)Abstact:Objective To establish a method of assaying the rosmarinic acid for the first time in perilla cake and linseed cake by using a new Smashing Tissue Extraction technology.Methods Orthogonal
4、 design was used to optimize the extraction condition and the content of rosmarinic acid in these cakes were analyzed by RP-HPLC with a kromasil symmetry C18(250 mm 4.6 mm , 5m) at the temprature of 30.The mobile solvent used for separation were 0.1% orthophosphoric acid in water (v/v) (eluent A) an
5、d methanol (eluent B). The gradient used was: 010min, maintain at 40% B; 1025 min,linear gradient from 40% to45% B, maintain at 45% B until 30 min. The flow rate was 1.0ml min-1 . Detection wavelength was 330 nm. The sample injection volume was 10l.Results: The optimization of STE process was the ra
6、tio of liquid to solid material at 10:1 and the power of extration at 150v,extracting 2 times (2 min at each time).The content of rosmarinic acid in perilla cake and linseed cake were 3.570mgg-1 and 0.01270 mgg-1, respectively.Conclusions HPLC method can apply to quickly determine the rosmarinic aci
7、d in perilla cake and linseed cake and the Smashing Tissue Extraction method has advantage on saving extraction time , raising extraction efficiency and maintaining the temperature sensitive constituents.Key words: Perilla cake and Linseed cake; Rosmarinic acid; STE ;HPLC 紫苏和亚麻为常见的两种油料作物，它们含有丰富的不饱和脂
8、肪酸。紫苏油中-亚麻酸含量高达55-65，是优良的保健食用油1。亚麻籽中也含有近52%的-亚麻酸，是迄今为止生物圈中生产成本最低,富含-亚麻酸植物2。目前对它们的开发利用主要集中于油脂类成分，在工业生产中产生大量的油粕则直接作为燃料或作为饲料喂养家畜，造成了一定的浪费。迷迭香酸（Rosmarinic acid,简称为RosA）是一种酚酸类物质，在自然界中主要存在于紫草科、唇形科、五加科、葫芦科、梧桐科等多种植物及其亚属中3。最早由两位意大利化学家Scarpati 和Oriente从迷迭香属(Rosmarnus officinalis L)植物中分离得到纯化合物单体4，故由此得名。它的化学结构属
9、于咖啡酸的二聚体衍生物，分子式为C18H16O8,化学命名为 R(E)-3-(3,4-二羟基苯基)-1-氧代-2-丙烯基氧基-3,4-二羟基苯烯酸5。结构式如下： Fig.1 Rosmarinic acid(RosA)已有大量研究证明，迷迭香酸具有广泛的生物活性，包括抗氧化6、抗病毒7、抗炎8、抗癌9、抗变态反应10、抑制吲哚胺2,3-二氧化酶表达11、抑制纤维细胞转化12 等，广泛应用于食品、化妆品及医药等方面。目前，有关迷迭香酸含量测定的文章有不少报道，但是它们大都是直接从原植物药材中或者是从药材的叶部位进行提取测定。未见有从药材提取过后的残渣中发现和检测迷迭香酸的报道。本文以提取过植物油
10、后的紫苏、亚麻籽油粕作为原料，应用新型的闪式提取技术进行工艺优选后，利用HPLC法首次从紫苏、亚麻籽油粕中发现并测定其中迷迭香酸的含量。这对紫苏、亚麻籽提（榨）取油后的残渣作为再生资源的开发利用具有重要的社会和经济意义。 1 仪器与材料 P3000A型高效液相分析色谱仪(北京创新科技有限公司)、UV3000紫外检测器(北京创新科技有限公司)、Kromasil ODS 色谱柱(250 mm 4.6 mm , 5m , 北京创新科技有限公司)、迷迭香酸对照品(天津尖峰天然产物研究开发有限公司，纯度98.0%)、KQ3200DB超声仪(昆山市超声仪器有限公司)、甲醇(色谱纯，天津康科德化学试剂厂)、
11、甲醇(分析纯，天津博迪化工股份有限公司)、磷酸(分析纯，沈阳市试剂五厂)、娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)、紫苏、亚麻籽油粕由沈阳佳时保健食品有限公司提供。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱：Kromasil ODS 色谱柱(200 mm 4.6 mm , 5m ,)；流动相：甲醇(B)-水(A,含体积分数为0.1%的磷酸)进行梯度洗脱(010min 40%B、1025min 45%B)；流速1.0mlmin-1 ,柱温30；检测波长330nm,进样量10l。2.2 供试品溶液的制备 精密称取脱脂后的干燥紫苏饼粕10.0g置于闪式提取罐中，加入体积分数为80%的甲醇100ml,快速调节
12、闪提功率至150V进行提取，提取2次，每次2min。回收溶剂，浸膏用甲醇溶解并转移至25ml的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。用0.45m滤膜过滤，滤液进行HPLC分析。2.3 对照品溶液的制备 精密称取迷迭香酸对照品5.0mg,置于10ml的容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1ml含0.50mg的对照品溶液。2.4 系统适用性试验 取2.2项下供试液5l，注入高效液相色谱仪测试，理论塔板数以迷迭香酸计不低于4000，迷迭香酸色谱峰与相邻色谱峰的分离度不小于1.5。2.4 标准曲线的绘制 取0.50mgml-1对照品溶液分别稀释为4、8、12、30、60、90、120、150、gml-
13、1的对照品溶液，用0.45m滤膜过滤，按上述色谱条件进行分析。以峰面积为纵坐标，以对照品的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得出迷迭香酸的回归方程为： Y=12470X+20164,r=0.9991.结果显示，迷迭香酸的质量浓度在5150gml-1内与峰面积成良好的线性关系。2.5 稳定性试验 精密称取脱脂干燥的紫苏油粕10.0g,按2.2项下制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12h内进样分析。结果表明，供试品溶液在12h内具有较好的稳定性，迷迭香酸峰面积的RSD为3.0%。2.6 精密度实验 精密称取同一批脱脂干燥的紫苏油粕10.0g,按2.2项下制备供试品溶液，连续进样6次，迷迭香
14、酸峰面积的RSD为1.2%。2.7 重复性试验 精密称取同一批脱脂干燥的紫苏油粕10.0g,按2.2项下制备供试品溶液，进样测定，迷迭香酸峰面积的RSD为2.7%(n=6)。2.8 加样回收率试验 精密称取同一批已知迷迭香酸含量的紫苏油粕6份，分别按低、中、高三种浓度加入一定量的迷迭香酸对照品溶液进行回收率测定，实验结果如下图所示：Fig.2 Recovery test of Rosmarinic acid(n=6)Componentmsample/gmoriginal/mgmadded/mgmtest/mgRecovery /%Average Recovery/%RSD/%RosA5.003
15、9.4460.609.60895.7100.12.35.0319.5490.609.99998.55.0099.4670.7510.38101.65.0169.4950.7510.37101.25.0129.4780.9010.65102.65.0089.4600.9010.45100.82.9 样品含量测定 分别取紫苏、亚麻籽油粕，按2.2项下方法制备供试品溶液，其中将紫苏供试品溶液稀释10倍后进行含量测定。结果显示，紫苏籽油粕中含迷迭香酸为3.570mgg-1，亚麻籽油粕中含迷迭香酸量较低为0.01270mgg-1。3 闪式提取研究 近年来，出现了一种全新的药材提取方法-闪式提取法(STE
16、)。该提取由闪式提取器完成。闪式提取器由破碎刀具、动力部分、升降系统、控制系统及物料容器所组成，它的原理是依据高速机械剪切力和超动分子渗透技术在室温及溶剂存在下，数秒内将植物料破碎至细微颗粒，并使有效成分迅速达到组织内外平衡，通过过滤达到提取目的。它能最大限度保留植物的有效成分不会受热破坏、溶剂用量少、提取时间短、效率高、刀具耐磨、结构紧凑、安全可靠，适用动、植物软、硬材料、水及多种有机溶剂，能提取各种天然活性成分13。 因此，本研究利用这一新型提取技术对上述油粕进行提取，并以迷迭香酸含量作为指标、通过正交设计考察了其最佳提取工艺。对影响闪提提取结果的料液比、提取时间、仪器工作时功率三个因素进
17、行单因素分析，分析结果见下图：Fig.3 闪式提取各因素影响趋势线由图中趋势线分析可知闪式提取120s、料液比为1:10、提取功率150V提取时迷迭香酸含量最高。在以提取时间、料液比和提取功率进行三因素、三水平的正交水平设计，也得出了与上述一样的结论，结果见如下图。Fig.4 因素水平表水平ABC料液比/g:ml提取时间/s提取功率/v11:86010021:109012031:15120150Fig.5 L9(34)正交实验结果实验编号ABCRosA含量 mg/g11110.975221221.04231331.91842121.35052231.81562311.52073131.4388
18、3211.24493321.327K13.9353.7633.739K24.6854.1013.719K34.0094.7655.171k11.3121.2541.246k21.5621.3671.240k31.3361.5881.724R0.74980.3340.484 从结果可以看出，影响迷迭香酸含量高低的因素依次为料液比提取功率提取时间。在提取时间和提取功率一致的情况下，A2水平迷迭香酸含量最高；在料液比和提取功率一样的前提下B3水平效果最好；在料液比和提取时间一样的前提下C3水平的效果最佳。结合分析结果，最终选定A2B3C3作为紫苏、亚麻籽油粕中迷迭香酸提取的最佳工艺。4.结果与讨论
19、本文首次从紫苏、亚麻籽油粕中发现了迷迭香酸的存在，并且首次应用HPLC法测定了紫苏、亚麻籽油粕中迷迭香酸的含量。紫苏叶中迷迭香酸含量的测定已有报道12,其含量为0.511%,而本文从紫苏油粕中测出了0.357%的迷迭香酸，含量与叶中接近。如果能将紫苏油粕作为再生资源二次开发利用，可为迷迭香酸的大量制备提供可能，且可产生较大的经济和社会效益。 实验所用的HPLC色谱条件是在参考有关文献的基础上1420，经过多次优化而来。实验中比较了甲醇-水(含0.1%磷酸)、甲醇-水(含0.1%甲酸)作为流动相时下的色谱图，发现前者的谱图比较尖锐，峰形较好，然后又比较了甲醇-水(含0.1%磷酸)40:60、45
20、:55以及本文所采用的梯度洗脱下三种不同比例的色谱图，发现在梯度条件下目标峰与相邻峰的分离度较好，均大于1.5。 本文首次运用一种新型的提取技术闪式技术(STE)优选了紫苏、亚麻油粕中迷迭香酸的提取工艺，达到了预期的效果。闪式提取由于在提取时间、提取效率上具有较大的优势，提示这一新技术的应用具有广阔的前景。参考文献1 余华峰,刘大川.异丙醇浸出紫苏籽低温压榨饼的研究J.中国油脂,2007,32(10).2 胡晓军,郭忠贤,赵毅.亚麻籽综合利用及开发前景浅析J.中国麻业,2002,24(5).3 Scarpati, M.L., Oriente, G., 1958. Isolamento e co
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