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1、.山东大学实验报告2017 年 12 月 4 日_科 目：微生物学实验题目：微生物鉴定常用的生理生化试验姓名：丁志康一、 目的要求1. 证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。2. 掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。3. 了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。4. 掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。5. 了解 IMViC 反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。二、 基本原理1、生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。 胞外酶只要为水解酶， 通过加水裂解大的物质为较小的
2、化合物，使其能被运输至细胞内。 如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖； 脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实；淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不在产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH ，使 pH 降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变成深红色，说明胞外存在着脂肪酶。2、糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌.能分解某种糖产生有机酸 （如
3、乳糖、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳的等）；有些细菌只产酸不产气。 例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨，指示剂（溴甲酚紫） ，倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（ pH6.8 ）变为黄色（ pH5.2 ）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。3、IMViC反应是吲哚试验、甲基红试验、伏- 普试验和柠檬酸试验4 个试验的首字母缩写。这四个实验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气杆菌，多用于水的细菌检查。（ 1）吲哚试验：某些细
4、菌有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸形成吲哚（靛基质），吲哚能与对二甲基氨基苯甲醛作用生成玫瑰吲哚而呈红色。（ 2）甲基红试验：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解成为甲酸、乙酸、琥珀酸等，使培养基pH 下降至 4.5 以下，加入甲基红指示剂可呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基 pH 在 5.4 以上，加入甲基红指示剂呈橘黄色。本试验常与 V-P 试验一起使用， 因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。（ 3）伏 - 普（二乙酰）试验：某些细菌能发生如下转换：葡萄糖丙酮酸（脱羧）乙酰甲基甲醇 2 ，3 丁
5、烯二醇，在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用产生粉红色的化合物。本试验目的在于测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。（ 4）柠檬酸试验：当细菌利用铵盐作为唯一氮源，并利用柠檬酸盐作为唯一碳源时，若细菌能利用这些盐作为氮源和碳源而生长， 则能利用柠檬酸钠产生碳酸盐， 从而与利用铵盐产生的氨反应，形成 NH4OH ，使培养基呈碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝（ BTB）由淡绿转为深蓝。.三、器材1.菌种 :枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，产气杆菌，铜绿假单胞菌，普通变形杆菌，金黄色葡萄球菌。2.培养基 :固体淀粉培养基，蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基， 葡萄糖发酵培养基，乳糖发酵培养基。3.溶
6、液或试剂 :革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红试剂，V.P.试剂，吲哚试剂。4.仪器或其他用具 :无菌平板，无菌试管，接种环，接种针，试管架，酒精灯，小玻璃管。四、操作步骤（一）淀粉水解试验(1) 将固体淀粉培养基融化后冷却至 50 左右，无菌操作制成平板。(2) 用记号笔在平板底部划成四部分。(3) 将枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单细胞菌分别在不同的部分点点接种，在平板的反面分别在四部分写上菌名。(4) 将平板倒置在 37 温箱中培养 24h 。(5) 观察各种细菌的生长情况，将平板打开盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平皿中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透
7、明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉酶能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。（二）糖发酵试验1.用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌菌名。2.取葡萄糖发酵培养基试管3 支，同样分别接入大肠杆菌， 普通变形杆菌，第三支不接种，.作为对照。在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。3.将接种过和作为对照的6 支试管均置 37 培养 2448h 。4.观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。（三） IMViC 试验（ 1） 接种与培养用接种环分别取一些大肠杆菌和产气杆菌的菌种，接入五只葡萄糖蛋白胨水培养基中以及三只蛋白胨水培养基
8、中，分别贴上标签注明培养基名称以及菌种名称，放入37 培养基中培养 48h 。（ 2） 结果观察1、吲哚试验：于培养 48 小时后的蛋白胨水培养基中滴入34 滴乙醚，摇动数次， 静置一分钟，待乙醚上升后， 沿试管壁徐徐加入2 滴吲哚试剂。 在乙醚与培养物之间产生红色环状物为阳性。2、甲基红试验：培养48 小时后，向一只葡萄糖蛋白胨水培养基内加入甲基红试剂2 滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。（注意甲基红不要假的太多，以免出现假阳性。）3、伏 - 普试验：培养48 小时后，向另外两只葡萄糖蛋白胨水培养基内加入510滴40%KOH ，然后加入等量的5% 的 - 萘酚试剂，用力震荡，再放
9、入37 恒温箱中保温1530分钟，以加快反应速度，若培养物呈现红色则为阳性。五、实验结果（一）淀粉水解试验.（左上为枯草芽孢杆菌；左下为产气杆菌；右上为大肠杆菌；右下为铜绿色假单胞菌）（ *因为金黄色葡萄球菌菌量剩余少，所以实验中菌余用量大的产气杆菌替代）观察结果如下：观察者：丁志康菌种枯草芽孢杆菌大肠杆菌铜绿色假单胞菌产气杆菌淀粉水解效果+（+ 表示阳性，即产胞外淀粉酶；+ 数量表示透明圈大小， + 越多透明圈越大）（二）糖发酵试验实验结果如图所示：左边三支试管分别是乳糖发酵培养基接种大肠杆菌、变形杆菌、空白对照。右边三支试管分别是葡萄糖发酵培养基接种大肠杆菌、变形杆菌、空白对照。.观察结果
10、如下：观察者：丁志康菌种大肠杆菌普通变形杆菌对照葡萄糖+-乳糖+-（ + 表示阳性， - 表示阴性；第一个格子代表是否产酸，第二个格子代表是否产气）（三） IMViC 试验（图一）（图二）（图三）1、图一中左一为大肠杆菌，左二为产气杆菌，左三为对照。2、图二中左一为产气杆菌（浅橙色） ，右一为大肠杆菌（淡紫红色） ，中间为对照（浅黄色） 。3、图三中左为大肠杆菌，右为产气杆菌。.观察结果汇总如下：观察者：丁志康菌种吲哚试验甲基红试验V.P.试验大肠杆菌+-产气杆菌-+对照-（+ 表示阳性， -表示阴性）甲基红试验中产气杆菌所在试管呈淡橙色，比对照组颜色略深，但远比大肠杆菌浅，记作阴性。六、思考
11、题(1) 你怎么样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？答：淀粉酶是大分子物质，无法通过跨膜运输进入胞内，所以消化淀粉的酶应当是由细胞分泌进入外界环境中，在胞外对淀粉进行水解，之后细胞再将消化处理后的小分子物质运输进胞内进行利用。(2) 不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？答：淀粉是葡萄糖的多聚体，在被淀粉酶水解过程中极有可能水解产生葡萄糖，而葡萄糖又是还原性糖，故可以尝试通过检测还原性糖的方式 （如斐林试剂）来验证是否有淀粉酶存在。(3) 假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？答：试管中培养基变为黄色，小玻璃管中出现气泡。(4) 讨论 IMViC 试验在医学检验上的意义。.答
12、： IMViC 试验可以非常快捷地鉴别出待测细菌的一些信息，从而可以结合伯杰氏手册对待测菌进行初步的鉴定，再结合革兰氏染色有时甚至可以做到对待测菌进行定科或定属的研究，这十分有利于细菌导致的传染病的临床治疗。此外，IMViC 试验还可以快速地鉴别出大肠杆菌和产气肠杆菌，这两种菌广泛存在于自然界，常被作为水源粪便污染的标志，所以IMViC试验也可广泛应用于饮用水的检测之中。七、附实验中所用培养基配方1、淀粉培养基蛋白胨10gNaCl5g牛肉膏5g可溶性淀粉2g琼脂1520g蒸馏水1000mL121 灭菌 20min 。2、蛋白胨水培养基蛋白胨10gNaCl5g蒸馏水1000mLpH7.6121
13、灭菌 20min 。3、葡萄糖蛋白胨水培养基.蛋白胨5g葡萄糖5g磷酸氢二钾2g蒸馏水1000mL将上述各成分溶于1000mL 水中，调 pH 7.07.2 ，过滤。分装试管，每管10mL,121 灭菌 30min 。4、糖发酵培养基蛋白胨水培养基1000mL1.6% 溴甲酚紫乙醇溶液12mLpH7.6另配 20% 糖溶液（葡萄糖以及乳糖）各10mL 。制法：1、将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（pH=7.6 ）分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管（ Durhamtube） ,使充满培养基。2、将已分装好的蛋白胨水和20% 的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水121 灭菌 20min ；糖溶液 112 灭菌 30min 。3、灭菌后，每管以无菌操作分别加入20% 的无菌糖溶液 0.5mL （按照每 10mL 培养基中加入 20% 的糖溶液 0.5mL ，则成 1% 的浓度）。配置用的试管必须洗干净，避免结果混乱。.