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1、。- 糖苷酶活力的测定（ CMC ）一 目的：掌握 CMC 酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。原理：纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na ）中分解出还原糖，还原糖又同 3 ，5- 而硝基水杨酸发生反应，产生一种黄橙混合色，用分光光度计可测定其色度，计算酶活力。二 试剂：13 ，5- 而硝基水杨酸显色剂（又称DNS 试剂）： 称取 10g3,5- 而硝基水杨酸，溶于蒸馏水中， 加入 20g 分析纯 NaOH ，200g 酒石酸钾钠，加税 500ml,升温溶解后，加入重蒸酚2g, 无水亚硫酸钠0.5g, 加热搅拌，待全部溶解后，定容至 1000ml 。贮存于棕色瓶中，室温保存，放置一周后
2、使用。20.1mol/L pH4.5醋酸 - 醋酸钠缓冲液：称取结晶醋酸钠（CH 3 COONa.3H2 O ）13.61g ，醋酸（CH 3 COOH ）6.00g ，用蒸馏水溶解，并定容至1000 ml ，配好后用 pH 计矫正。31mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取 100mg 分析纯葡萄糖（预先在 70 、600nm汞柱下干燥 5h 至恒重），用少量蒸馏水溶解并定容至100ml ，冰箱中保存备用。4代测酶液：称取酶粉 1.0g（或吸取酶液 1.00ml ），先用少量的 0.05mol/LpH4.5 醋酸 - 醋酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣部分
3、再加上述缓冲液溶解，如此反复捣研 3-4 次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，40 水浴锅中浸提 1h ，用四层纱布或脱脂-可编辑修改 -。棉过滤，滤液供测定用。5底物：0.5% 羧甲基纤维素钠（CMC-Na ）溶液，配制方法为城区0.5000g羧甲基纤维素钠（ Sigma 公司生产），准确至 0.001g, 用上述缓冲液溶解定容至100ml, 冰箱中保存，有效期3d 。三 仪器：分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。四 方法步骤：1 标准曲线的绘制分别吸取 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4ml的 1mg/ml葡萄糖液于 7 支20ml
4、 的比色管中，分别用蒸馏水补充体积至2.oml, 各加 3 ，5- 而硝基水杨酸 1.5ml, 在沸水浴中煮沸5min ，冷却后分别用蒸馏水定容至20ml ，摇匀。以 2ml 蒸馏水加 DNS 溶液 1.5ml, 按上述同样操作为空白调零， 在540nm处比色。标准曲线绘制个试管所含物质的体积见下表。以吸光度A 值为纵坐标，葡萄糖毫克数W(mg) 为横坐标绘制出标准曲线（理论上此线应过原点）。标准曲线绘制各试管所含物质的体积管号空白1234567葡萄糖液 /ml00.20.40.60.81.01.21.4蒸馏水 /ml2.01.81.61.41.21.00.80.6DNS/ml1.51.51.
5、51.51.51.51.51.5葡萄糖量 /mg00.20.40.60.81.01.21.42 酶样测定-可编辑修改 -。取 20ml 比色管 1 支，加入 0.5mol/L pH4.5 醋酸 - 醋酸钠缓冲液 1.5ml和 6 小片 1cm 1cm 滤纸后，再加适当稀释的酶液0.5ml, 于 40 下保温1h 后，再加适当稀释的酶液0.5ml ，于 40 下保温 1h 后，加 DNS 液1.5ml, 在沸水煮沸 5min 显色，流水冷却，用蒸馏水定容至20ml, 摇匀；另取一支试管，加缓冲液和滤纸后，先加DNS 液，再加缓冲液0.5ml,同样显色、冷却、定容作为空白，在波长540nm比色，测
6、定 A 值，查标准曲线得出相应的葡萄糖含量W 。五 计算酶的比活力定义：在 40 ，pH4.5 条件下，每小时催化滤纸产生相当于1ug分子葡萄糖的还原糖所需的酶量定义为1 个酶活力单位，以U/g 表示。W 1000 nX = -0.5 180 30式中， X- 样品酶的活力， U/g(ug/ml);W- 查标准曲线得出相应的葡萄糖含量，mg;1000-mg换算成 ug 的换算系数；0.5- 吸取酶液的量， ml ；180- 葡萄糖分子量；n- 稀释倍数；30- 反应时间， min 。-可编辑修改 -。THANKS !致力为企业和个人提供合同协议，策划案计划书， 学习课件等等打造全网一站式需求欢迎您的下载，资料仅供参考-可编辑修改 -