《5.3 血红蛋白的提取和分离[第二课时 教案](高中生物选修一教案系列).doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《5.3 血红蛋白的提取和分离[第二课时 教案](高中生物选修一教案系列).doc（3页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、课题3 血红蛋白的提取和分离第二课时生动教师组织与引导教图复习提问：凝胶色谱法和凝胶电泳法有何区别？生答：略师总结；从蛋白质分子的作用力看：凝胶色谱法依靠重力分离，凝胶电泳法依靠电场力分离；从洗脱的先后顺序看：凝胶色谱法首先洗脱出来的是大分子的蛋白质；凝胶电泳法首先洗脱出来的是小分子的蛋白质。引言：血红蛋白的提取和分离的实验操作是怎样进行的呢？-引导学生阅读教材P66,并完成学案:二、实验操作：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。（一）样品处理红细胞中有一种非常重要的蛋白质血红蛋白，它有4个肽链组成，包括两个肽链和两个-肽链，其中每条肽链环绕一个亚铁血红蛋白基团，
2、此基团可携带一分子氧或一分子的CO2。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。师讲述：猪、牛、羊或其他脊椎动物的红细胞中都含有大量的血红蛋白。因此，我们可以用猪血、牛血、羊血等用来提取和分离血红蛋白。师：选用猪、牛、羊的血液来分离血红蛋白，有什么优点？生答：没有细胞核，使分离过程中要除去的杂质大大减少，使实验更容易成功。引言：提取和分离血红蛋白的第一步是收集血红蛋白溶液。即样品处理。包括三个步骤：1、 红细胞的洗涤。目的： 。 操作：血液样品（加入 ，防止 ） 低速短时间离心（500r/min、2min） 红细胞液 加入生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液）、搅拌、低速短时间离心 重复洗涤三次
3、红细胞（洗涤干净）思考：、红细胞洗涤的目的是什么？生答：去除杂蛋白。、获取血液样品时，在采血容器中要预先加入抗凝血剂柠檬酸钠，目的是什么？生答：防止血液凝固。、洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？生答：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不致于使红细胞吸水破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，会使血红蛋白与杂质蛋白混合，加大了分离的难度。、洗涤时，要做到搅拌、低速短时间离心、 重复洗涤三次。如果洗涤次数过少，会出现什么结果？离心的目的是什么？离心速度过高和时间过长，又会出现什么结果？生答：无法除去血浆蛋白；将血液分层，便于用胶头吸管吸出黄色血浆；使白细胞、血小板等一同沉淀
4、，达不到分离的效果 2血红蛋白的释放操作：红细胞（洗涤干净） 加 和 红细胞破裂，释放出血红蛋白 含血红蛋白的混合液思考：在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？生答：加入蒸馏水使红细胞吸水胀破，释放出血红蛋白；细胞膜的主要成分是磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂。加入甲苯可加速红细胞的破裂，释放出血红蛋白。 3分离血红蛋白溶液操作：含血红蛋白的混合液 高速离心（2000r/min、10min） 溶液分层（4层，从上到下依次是：无色透明的甲苯层、白色的脂溶性物质沉淀层、血红蛋白溶液、其他杂质的暗红色沉淀物） 滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层 分液漏斗 血红蛋白溶液（红色透明）思考：获取血红蛋白溶
5、液后，高速离心的目的是什么？生答：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于分离出血红蛋白溶液。引言：获取血红蛋白溶液，下一步要对其进行粗分离。 （二）粗分离 方法： 目的： 原理： 操作：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将其放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲认中（pH为7。0），透析12h。思考：粗分离的方法、目的、原理是什么？生答：方法是透析。目的是除去样品中相对分子质量较小的杂质。原理是透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。 （三）纯化 方法： 目的： 。1凝胶色谱柱的制作（了解、学生自学）2凝胶色谱柱的装填 操作：交联葡聚糖凝胶（G75）用蒸馏水
6、溶胀凝胶悬浮液倒入色谱柱内装填连接缓冲溶液洗脱瓶用磷酸缓冲液（物质的量浓度为20mmol/L，pH为7.0）充分洗涤平衡注意：使凝胶装填紧密、均匀，色谱柱内不能有气泡存在。（气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果）思考：、纯化的方法及目的是什么？生答：方法：凝胶色谱法。目的：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。、凝胶色谱柱的装填有什么要求？为什么？生答：尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；不得有气泡存在,气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒现象。商品凝胶是干燥颗粒，应如何使用？有何优点？生答：使用前需直接放在洗脱
7、液中膨胀，为了加速膨胀可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾1-2h。优点：不但节约时间，还可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。 3样品的加入和洗脱加样品：用吸管将透析后的样品贴着管壁加样，注意不要破坏凝胶面 样品渗入凝胶床内 加磷酸缓冲液（物质的量浓度为20mmol/L，pH为7.0） 连接缓冲溶液洗脱瓶，进行洗脱 收集血红蛋白（红色）思考：1、在凝胶色谱操作过程中，需要注意什么问题？生答：不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。否则，凝胶色谱柱需要重新装填。如何判断色谱柱制作成功？生答：在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀、狭窄、平整、缓慢一致地移动，说明色谱柱制作成功。（四）纯度鉴定（选学-学生自学）方法：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳思考：纯度鉴定后的结果如何分析？（如右上图所示：与标准血红蛋白样液的比较：说明血红蛋白的分子质量是30KDa）操作提示：略（实验操作中应注意的问题，在蛋白质的提取和分离中已经分析，学生自学）小结：略 板书设计：略 达标测评：略