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1、文件编号:版本:邕试剂灵敏度复核试验作业指导书修订历史记录至多存五版的历史修订记录版本发行日期文件更改申请编号修改内容1.0目的对细菌内毒素检查试验所用的邕试剂的灵敏度进行复核。2.0职责质量与法规部负责本规程的起草，QC及相关人员执行本规程。3.0范围适用于本公司细菌内毒素检查法。4.0参考文件2010年版中国药典二部 附录XI E细菌内毒素检查法2010年版中国药品检验标准操作规范细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法及其应用第一版，气象出版社5.0定义邕试剂灵敏度复核试验：在细菌内毒素检查法规定的条件下，使邕试剂产生凝集的内毒素 的最低浓度即为邕试剂的标示灵敏度（入），用EU/ml表示。当使用
2、新批号的邕试剂或试 验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行邕试剂灵敏度复核试验。反应终点浓度：指邕试剂灵敏度复核试验中，系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结 果的浓度。6.0设备/工具及物料6.1 设备/工具设备/工具|数显恒温水浴箱电热恒温水浴锅电热干燥箱混匀器水银温度计可调式移液器无热原安甑无热原吸嘴试管架W封口膜6.2 物料6.2.1 细菌内毒素工作标准品除另有规定外，使用由中国药品生物制品检定所统发放的标准品。6.2.2 细菌内毒素检查用水指内毒素含量小于0.015EU/ml （凝胶法）且对内毒素试 验无干扰的灭菌注射用水。6.2.3 邕试剂规格一般选用0.25 EU/ml
3、。7.0操作步骤7.1 提前30 min开启超净工作台，试验操作过程中不要开启风机，完毕后用 75%乙醇擦拭 超净工作台。试验操作过程应防止微生物和细菌内毒素污染。7.2 制备细菌内毒素标准溶液7.2.1 取细菌内毒素工作标准品1支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈上部 划痕，用75%乙醇擦拭后启开，避免玻璃屑落入瓶内。7.2.2 按照工作标准品说明书，加入细菌内毒素检查用水溶解。封口膜封口，置漩涡 混合器上混匀15 min后用细菌内毒素检查用水进行稀释，制成 2.0卜1.0卜 0.5卜0.25人四个浓度的内毒素标准溶液。每稀释一步均应在漩涡混合器上混 匀 30 So注：在使用过程中，标准
4、品溶液若静置超 10min,必须重新混匀30s再重新使用。7.2.3 试验举例设细菌内毒素工作标准品为100 EU/支；待测邕试剂 入=0.25 EU/ml。稀释过程 如下： 取细菌内毒素标准品100 EU/支+1 ml检查用水 100 EU/ml取 0.2 ml 100 EU/ml 溶液+1.8 ml 检查用水一 10 EU/ml取 0.2 ml 10 EU/ml 溶液+1.8 ml 检查用水 f 1 EU/ml取 0.9 ml 1 EU/ml 溶液+0.9 ml 检查用水 一 0.5 EU/ml取 0.9 ml 0.5 EU/ml 溶液+0.9 ml 检查用水 0.25 EU/ml取 0.
5、9 ml 0.25 EU/ml 溶液+0.9 ml 检查用水 0.125 EU/ml取 0.9 ml 0.125 EU/ml 溶液+0.9 ml 检查用水一 0.0625 EU/ml即得2.0入1.0卜0.5卜0.25人四个浓度的内毒素标准溶液。7.3 溶解邕试剂7.3.1 取0.1 ml装量的邕试剂18支，安甑开启过程同6.2.1工作标准品。7.3.2 每支邕试剂加入0.1 ml细菌内毒素检查用水溶解，在试管架上按下面的形状排 歹I。注：在复溶邕试剂时，应使用可调式移液器连接无热原吸嘴加样，而不是使用移液 管加样。邕试剂复溶后不能放到漩涡混合器上去混合，因为强烈混合容易使复溶后 的邕试剂产生
6、泡沫，影响凝胶的形成。实际上只需将邕试剂复溶后静置12分钟邕试剂就可变澄清。- 5J _ )，_ - 3( - - 2( .一： ,一 17.4加样（邕试剂安甑排列 如下图）第1列每支加入2.0人浓度的细菌内毒素标准溶液 0.1 ml第2列每支加入1.0人浓度的细菌内毒素标准溶液 0.1 ml第3列每支加入0.5人浓度的细菌内毒素标准溶液0.1 ml第4列每支加入0.25人浓度的细菌内毒素标准溶液0.1 ml第5列每支加入细菌内毒素检查用水 0.1 ml,作为阴性对照注：每次加样浓度必须是从高到低，加不同浓度的样品需更换新的移液器吸嘴。7.5 加样结束后，用封口膜封口，将邕试剂安甑中溶液轻轻混
7、匀，应避免产生气泡，连同 试管架垂直放入37 c 1C的恒温水浴箱中，试管架保持水平状态，保温 60 min 2 min o使用温度计监测恒温水浴箱温度是否满足实验要求，每 30分钟进行温度记录，记录 表格参见。7.6 判断及计算7.6.1 将邕试剂安甑从恒温水浴箱中轻轻取出，缓缓倒转180。，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性牛”；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑落者为阴性 -注：保温和拿取邕试剂安甑的过程应避免受到振动造成假阴性结果。7.6.2 当最大浓度2.0入4管均为阳性，最低浓度0.25入4管均为阴性，阴性对照管为 阴性，试验方为有效。7.6.3 按下式
8、计算反应终点浓度的几何平均值，即为邕试剂灵敏度的测定值（九）。3lg -1 （ 2 X/4）式中X为反应终点浓度的对数值（lg）0反应终点浓度是系列递减的内毒素标准 溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。当左在0.5心2入（包括0.5人和2入）时，判定该批邕试剂灵敏度复核合格，方 可用于干扰试验和供应品细菌内毒素检查，并以标示灵敏度 人为该批邕试剂的灵敏度。7.6.4 试验举例如果待复核的邕试剂的标示灵敏度为0.25 EU/ml ,试验结果如下：内毒素标准2.0人1.0人0.5人0.25 人阴性反应终点溶液浓度(EU/ml)(0.5)(0.25)(0.125)(0.0625)对照浓度(EU/ml )重1+0.25复2+0.25管3+空0.125数4+一一空0.25则邕试剂灵敏度的测定值%=ig -1 (-X/4=lg -1 (lg0.25 + lg0.25 + lg0.125 + lg0.25) / 4=0.21 EU/ml结果左在0.5人2.0人范围内，符合规定。以标示灵敏度0.25EU/ml为该批邕试剂的 灵敏度入。8.0记录和表格设备温度记录表邕试剂灵敏度复核试验报告注：在细菌内毒素测试报告中填写复核数据、复核结果、日期、检测人签名等相关内容。