体内药物分析生物样品与样品制备课件.ppt

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1、体内药物分析生物样品与样品制备,1,第三章 生物样品与样品制备,药物分析教研室,体内药物分析生物样品与样品制备,生物样本,体内药物分析生物样品与样品制备,学习要求,掌握 常用生物 样本（血液、尿液及组织）的采集、制备、贮存及预处理方法。 熟悉常用样品的预处理技术。 了解非常用样本的制备与处理方法。,体内药物分析生物样品与样品制备,选择生物样本的实验原则,反映浓度与药效之间的关系,1,易于获得，方便研究,2,便于处理，适合分析,3,根据不同目的与要求选取,4,如：TDM、药动学研究选血液、唾液等；药物代谢物研究选血液、尿液；ADMET研究选取？,体内药物分析生物样品与样品制备,5,第一节生物样品

2、的种类、采集、制备与贮存,体内药物分析生物样品与样品制备,6,一、生物样品的种类、采集和制备,体内药物分析常用的分析品种有血液、尿液、脏器组织、唾液、头发，也可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等。 其中最常用的是血浆或血清，因为它们可以较好地体现药物浓度和治疗之间的关系。,体内药物分析生物样品与样品制备,7,（一）血液,血样的制备，如果你取血样会选择血浆、血清还是全血？,体内药物分析生物样品与样品制备,8,血液的组成,体内药物分析生物样品与样品制备,9,血样的采集,供测定的血样应能代表整个血药浓度，因而应待药物在血液中分布均匀后取样。 动物实验：可直接从动脉、静脉或心脏取血

3、。 病人：通常采取静脉血。 末梢血：当血药浓度高和分析方法灵敏时，也可从毛细管（手指、耳垂、脚趾）采少量血。,体内药物分析生物样品与样品制备,采集注意事项,1:1-5ml，动物总血量1/10 2:避免溶血,3:血样是创伤性获得，尤其是多次采样 4:用于药代动力学、血药浓度监测,根据不同的分析目的和要求进行选取,体内药物分析生物样品与样品制备,11,血样的制备,测定血中药物浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。,体内药物分析生物样品与样品制备,12,血样,全血(whole blood) 全血含有血球，药物在血球内与血浆中的浓度比由于受各种因素的影响而变化

4、 血球膜及血红蛋白会妨碍药物浓度的测定 血浆(plasma) 血清(serum),体内药物分析生物样品与样品制备,13,（1）血浆的制备,血液置于含有抗凝剂（如：肝素、草酸盐等）的试管中，混合后，离心，分离血细胞，淡黄色上清液即为血浆。,体内药物分析生物样品与样品制备,14,制备条件,抗凝剂：肝素(heparin)15IU抗凝1ml血浆 离心：25003000r min-1低速离心510 min 取上清液（淡黄色）,体内药物分析生物样品与样品制备,15,（2）血清的制备,采集的静脉血液置试管中，放置0.5 1 h，由于激活了一系列凝血因子，血中的纤维蛋白原形成纤维蛋白，血液逐渐凝固，离心后上层

5、澄清的淡黄色液体即为血清。,体内药物分析生物样品与样品制备,16,血浆与血清的相同之处,药物浓度相同 Cplasma=Cserum 因此： 血清和血浆可任意选用 分析方法相互通用 血药浓度，均指药物的总浓度（游离型+结合型）,体内药物分析生物样品与样品制备,17,（3）全血的制备,采集的血液置于含有抗凝剂的试管中，轻轻混匀，不离心，防止凝血，保持血浆和血细胞混合在一起。,体内药物分析生物样品与样品制备,18,使用全血的原因,需要测全血中血药浓度的情况 测定平均分布于血细胞内、外的血药浓度 血浆药物浓度波动大，且难以控制 血浆药物浓度太低,2021/6/4,体内药物分析生物样品与样品制备,示例：

6、,环孢素A的全血浓度的测定,体内药物分析生物样品与样品制备,20,血样主要应用于： 药物动力学 生物利用度 临床治疗药物浓度监测,血样的应用,体内药物分析生物样品与样品制备,21,血样的缺点 损伤性采样，取样量受到限制（15ml） 繁琐，多次采血 病人/受试者不愿配合 由专人进行,体内药物分析生物样品与样品制备,22,（二）尿液,尿药测定的目的与血液、唾液样品不同，主要用于药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度的研究 可推断患者是否违反医嘱用药 预测药物的代谢过程及测定代谢类型,体内药物分析生物样品与样品制备,23,尿液,1:尿液特点 量大；非创伤性；尿液中药浓度较高。 2:尿液缺点 食物

7、饮；水影响；排汗。 3:尿液性质 淡黄色；成人日量1-5L；pH4.8-8.0；加防腐剂贮存。 4:采集方法 采集24h尿液：8时排尿弃去，立即服药，尿液收集容器中，次日8时最后一次收集；分段收集 5:肾功影响药物的排泄 尿药浓度与血药浓度相关性差；有些难收集（如小孩）。,体内药物分析生物样品与样品制备,24,动物试验中用代谢笼收集尿、粪，只能以时间段采集，有时会有收集不到的情况。 尿药浓度变化大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。 尿样测定多用于药物排泄、生物转化研究。,体内药物分析生物样品与样品制备,25,优 点,容易获得，属非损伤性取样，且样品量大； 尿中药物浓度高，含有缀合物或代谢物

8、，是研究代谢物结构的首选样品； 蛋白含量极低，不需去蛋白处理。,缺 点,与血药浓度不相关，难以反映药物作用过程； 受肾功能、pH影响； 难以定时定量取样，易污染； 所含成分复杂，已知其中有紫外吸收的化合物就达数十种。,体内药物分析生物样品与样品制备,26,（三）组织,在药物动物试验及临床上由于过量服用药物而引起的中毒死亡时，药物在脏器中的分布情况可为药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程提供重要信息。首先，将检材均匀化，制成水基质溶液，再用适当方法提取。,体内药物分析生物样品与样品制备,27,组织常用提取方法：,（1）匀浆化法（简单，回收率低） （2）沉淀蛋白法（简单，回收率低） （3）酸水解

9、或碱水解（适合于酸碱条件下稳定的药物或毒物） （4）酶水解法（避免高温降解，不适合碱性条件下水解的药物或毒物）,体内药物分析生物样品与样品制备,实例：,以下可采取哪种样品提取方法： 1）利多卡因在肝脏中的组织分布？ 2）阿司匹林在心脏中的组织分布,体内药物分析生物样品与样品制备,29,（四）其他生物样品（自学）,乳汁（乳汁和新生儿） 精液 泪液 头发 唾液 ,体内药物分析生物样品与样品制备,30,二、生物样品的贮存与处理,（一） 冷藏或冷冻 采样后除立即分析外，为防止药物发生变化，应： 短期保存，可 4 冷藏 长期保存，可-20 冷冻或低温冷柜(-80)冷冻 ，避免反复冻融。,冷藏或冷冻时限经

10、稳定性考察后确定,体内药物分析生物样品与样品制备,31,采集后及时分离血浆和血清（2h），分离后再贮存。 若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离。 置硬质玻璃试管或完全密塞后保存。 反复冻融一般不超过2次，可采用分装的方法。,血样,体内药物分析生物样品与样品制备,32,尿样 采集后应立即测定，若不能立即测定，加入防腐剂后保存 常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、浓盐酸等 甲苯在尿液表面形成薄膜 醋酸改变尿液酸碱性抑制细菌的生长 保存时间为24-36h(4)或长期(-20),体内药物分析生物样品与样品制备,33,（二）去酶活,酶抑制剂：一些酯类药物，如

11、普鲁卡因、阿糖胞苷，易受血浆酯酶作用而发生水解，则应在采样后立即加入酶抑制剂如氟化钠等。 抗氧化剂：一些易氧化的药物，可加入VC或其它抗氧化剂。如血浆中儿茶酚类药物常规保存仅4周，若加入适量VC，则能保存10周。,体内药物分析生物样品与样品制备,34,奥氮平，很容易被空气氧化，因此在样品的储存和提取时加入了25%的维生素C 溶液10ul 作为抗氧剂,体内药物分析生物样品与样品制备,35,第二节 生物样品的预处理与制备,进行体内药物分析时，除了极少数情况下只需将样品进行简单处理就可以直接测定外，都要采取分离、净化、浓缩、化学衍生化等预处理技术，为测定创造良好的条件。,体内药物分析生物样品与样品制

12、备,36,样品预处理是分析中最困难、最繁复的工作。 药物进入生物体后： 体内存在形式不同、待测药物浓度低、生物介质组份繁杂、待测药物类型众多、理化性质各异,体内药物分析生物样品与样品制备,37,60%以上工作和费用用在样品前处理上,1）样品预处理所用时间远大于分析的时间 2）占分析的消耗总成本最大 3）消耗大量的溶剂及其他化学品 4）实验的重复性及准确性最差的环节 因此是影响实验结果好坏的最重要因素,体内药物分析生物样品与样品制备,38,第二节 生物样品的预处理与制备,体内药物分析生物样品与样品制备,药物分析样本预处理的目的,适应分析方法的要求 消除药物制剂的处方组成 多数具有特征结构和取代基

13、的原料药可不经处理，直接溶剂溶解分析。,体内药物分析生物样品与样品制备,药物分析样品前处理方法,1、不经有机破坏的前处理方法 不对药物的有机结构进行完全破坏，简单回流将待测原子解离为无机离子测定。 方法 ：水解、还原法 如：十一烯酸锌（酸水解）、三氯叔丁醇（碱水解、碘他拉酸（还原法） 2、经有机破坏的前处理方法 1中方法难以实现，有机方法。 方法：湿法、干法,体内药物分析生物样品与样品制备,41,一、生物样品预处理的目的,使药物从缀合物及结合物中释放 -测定药物总浓度 2.纯化、富集样品 -消除基质的干扰 3.满足测定方法对分析样品的要求 -提高检测灵敏度 4.保护仪器性能，改善分析条件-改善

14、耐受,体内药物分析生物样品与样品制备,42,二、样品制备时应考虑的问题,待测组分的理化性质、体内存在形式、浓度范围； 测定目的； 生物样品种类和介质干扰类型； 样品的化学组成； 药物的蛋白结合率； 待测组分在预处理中的稳定性； 样品在收集、储存、预处理过程中容器的污染； 预处理过程尽量简单、尽可能高的精密度和准确度； 预处理的最后一步应使待测组分富集； 所选用的分析方法的专属性、灵敏度、分离能力,体内药物分析生物样品与样品制备,43,1药物理化性质 pKa、亲脂性、挥发性、溶解度、光谱特征、稳定性、血浆蛋白结合率 2浓度范围 3测定的目的 定性？定量？母体？代谢？ 4选用生物样品的种类 5样品

15、处理与分析技术的关系 要求 专一性、 灵敏性,体内药物分析生物样品与样品制备,44,三、常用生物样品预处理技术,常用生物样品的预处理大致分为有机破坏法、去除蛋白质法、分离纯化与浓集法、缀合物的水解及化学衍生化法,体内药物分析生物样品与样品制备,45,（一）、有机破坏法,湿法破坏 硝酸-高氯酸法；电热消化器法；电热板消化法； 烘箱消化法。 干法破坏 高温电阻炉灰化法；低温等离子灰化法 氧瓶燃烧法 以上方法将有机物破坏后，只能进行元素分析，同同时应考虑内源性物质的干扰。,体内药物分析生物样品与样品制备,46,（二）、去除蛋白质,去除蛋白的目的： 可使结合型的药物释放出来，以便测定药物的总浓度； 可

16、预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成； 可以保护仪器性能，延长使用期限,体内药物分析生物样品与样品制备,47,常用去除蛋白方法,溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂 操作简单，快速，精密度好，特别在LC-MS法中常用 优点：与血浆蛋白形成的沉淀致密，易离心出去，且沉淀不会挟带走药物。 局限：上清液中的微量蛋白可能阻塞HPLC柱，不易挥干浓集。,体内药物分析生物样品与样品制备,48,2. 加入中性盐,中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。 常用饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。,体内药物分析生物样品与样品制备,49,其他方法,3. 加入强酸 4. 加入含锌盐及

17、铜盐的沉淀剂 5. 超滤法 6. 加热法 7. 酶水解法 适用条件：组织样本或血浆蛋白结合率高的血样 方法：枯草菌溶素，无需剧烈条件，水解后可有机溶剂提取。！：不适于在碱性下易水解的药物（PH7.0-11.0)。,体内药物分析生物样品与样品制备,50,以上去除蛋白质的方法仅去除了蛋白质（只起到保护色谱柱的作用），但内源性的杂质都在，样品浓度还被稀释。基本上不能用光谱法测定。 若用色谱法分离，干扰严重，就得花更多的精力才能分离好。 对色谱法来说，它不是好方法。,体内药物分析生物样品与样品制备,51,（三）分离、纯化与富集,生物样品含有大量可影响测定的内源性杂质，加上服用的药物、代谢物等组成一个极

18、其复杂的混合物。 如何将微量的药物从如此复杂的混合物中分离出来？ 采取的措施：分离、纯化,体内药物分析生物样品与样品制备,52,1. 液-液萃取法（LLE）,（liquid-liquid extraction，LLE）原理： 多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度， 而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质（差别）。 因而，用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后测定。,体内药物分析生物样品与样品制备,53,采用LLE要考虑的几个问题,（1）溶剂的选择与纯度要求（AR以上） 了解药物与溶剂的化学结构与性质，按相似相溶原则选用；对

19、药物的未电离分子可溶，而对电离形式的分子不溶（光谱分析法）；沸点低、易挥发、浓集；与水不相混溶无毒，不易燃烧；不易形成乳化（氯仿易乳化，毒性大）；具有较高的化学稳定性和惰性；不影响紫外测定（如苯类） （毒性大的溶剂尽量不用）,体内药物分析生物样品与样品制备,液液萃取的溶剂,体内药物分析生物样品与样品制备,55,（2）有机溶剂相和水相的体积,一般为11或21 由实际情况决定，文献中有的101以上,体内药物分析生物样品与样品制备,56,（3）水相的pH值,主要由药物的pKa决定 当pH与pKa相当时，50%药物以非电离形式存在。 对于碱性药物，最佳pH值要高于pKa 1-2单位；对于酸性药物，则要

20、低于pKa值1-2单位。 这样就可使90%的药物以非电离的形式存在从而更易溶于有机溶剂中 示例：如丙戊酸的pKa4.95，那么最适宜pH是？,体内药物分析生物样品与样品制备,57,但生物样品一般多在碱性下提取。 因为多数药物是亲脂性的碱性物质，而生物样品中内源性物质多是酸性的，在碱性下用有机溶剂提取时内源性杂质不会被提取出来,体内药物分析生物样品与样品制备,58,2.固相萃取法,固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE) 是从八十年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术。由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来。主要通过固相填料对样品组分的选择性吸咐及解吸过程，实现对样品的

21、分离，纯化和富集。 主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。,体内药物分析生物样品与样品制备,59,基本原理和方法：,SPE 技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。,体内药物分析生物样品与样品制备,60,较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出。,针管式 抽空减压 加压 过滤,体内药物分析生物样品与样品制备,61,关于固相

22、萃取小柱： a.常见的固相萃取柱分为三部分：医用聚丙烯柱管，多孔聚丙烯筛板(20m)和填料(多为40-60m，80-100m)。,b.常用规格：100mg/1ml，200mg/3ml，500mg/3ml，1g/6ml等。 以100mg/1ml为例：其中100mg为填料的质量，1ml是空柱管的体积。 c.一次性使用：为避免交叉污染，保证检测可靠性，SPE柱通常是一次性使用的。,体内药物分析生物样品与样品制备,62,亲脂性键合相硅胶SPE柱的实验步骤：,固相萃取操作一般有五步： 活化甲醇润湿小柱，活化填料，除去杂质并创造一定的溶剂环境。 平衡水或适当缓冲液冲洗小柱，保持湿润？ 上样将样品用一定的溶

23、剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。弃去废液 淋洗水或缓冲液最大程度除去干扰物。 洗脱用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。,体内药物分析生物样品与样品制备,63,操作步骤,体内药物分析生物样品与样品制备,64,体内药物分析生物样品与样品制备,65,SPE优点：,1、不发生乳化； 2、适应的极性范围较广； 3、提取效率高； 4、方便快速； 5、溶剂用量少； 6、易于自动化； 7、室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定的药物。,体内药物分析生物样品与样品制备,66,三种方法的优缺点比较,体内药物分析生物样品与样品制备,67,4.固相微萃取法,类似于气相色谱微量进样器的萃取装置,熔融石英纤维

24、上面涂有有机聚合物(如聚二甲基硅氧烷，PDMS),SPME 集萃取、浓缩、进样于一身，极大地提高了分析速度。萃取模式可分为直接固相微萃取和顶空固相微萃取,体内药物分析生物样品与样品制备,68,（四）缀合物的水解,尿中药物多数呈缀合状态。含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物； 含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。 由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取，常用酸水解或酶水解的方法。,体内药物分析生物样品与样品制备,69,3）溶剂解：缀合物（主要是硫酸酯）往往可通过加入的溶剂在萃取过程中被分解。,2）酶水解：葡萄糖醛酸苷

25、酶或硫酸酯酶，也可用二者的混和物。一般在pH4.5-7，37数小时，条件温和，选择性强，但费用较高。,1）酸水解：0.1N HCl，100，30min， 条件较剧烈，易致药物分解，空白值也高。,为测定尿液中药物总量，要将缀合物水解：,体内药物分析生物样品与样品制备,70,（五）化学衍生化,药物分子中含有活泼H者均可被化学衍生化，如含一COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能团的药物都可被衍生化。,色谱分析是分离分析方法，大部分样品处理后就可上样分析，但某些药物或代谢物极性大、挥发性低、对热不稳定、与其它物质分离不好或对检测器不够灵敏，因此，需要先进行衍生化反应，然后测定衍生物。,体内药物分析生物样品与样品制备,衍生化反应的特点,（1）紫外分光光度法 紫外没有吸收或吸收小的药物 （2）荧光光度法 不具天然荧光的药物 （3）色谱分析法 极性大、挥发性低、热不稳定、检测灵敏度不够 A:GC法中的化学衍生化法 使极性药物变成非极性的、易挥发 法的药物；增加药物稳定性；提高光学异构体的分离能力 主要衍生化反应 硅烷化：R-OH；R-COOH；R-NH-R等极性基团药物 酰化：R-OH；R-NH2；R-NH-R等极性基团药物,体内药物分析生物样品与样品制备,新技术,