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1、林蛙油蛋白及酶解肽的制备与抗氧化活性研究林蛙油是雌性林蛙输卵管的干燥品,是收录中国药典的中药材。蛋白质是林蛙油中主要活性成分,占到 50%以上,水溶性林蛙油蛋白（PEOR）具有抗氧化、 抗疲劳、抗衰老和增强机体免疫力等作用。因此,为系统研究 PEOR,基于活性保留,本论文结合抗氧化活性跟踪首先对PEOR 的提取工艺进行研究,并进一步考察其体内外抗氧化活性和抗疲劳作用,发现:PEOR 体内抗氧化活性高,而体外作用弱。基于此,本论文模拟蛋白体内消化过程与程序,采用胃蛋白酶/胰蛋白酶分步水解法制备林蛙油酶解肽,并对其氨基酸 组成与抗氧化活性进行研究。应用水提法提取 PEOR,结合 DPPH 清除率,
2、以 pH 值、料液比、提取时间、提取次数和浸提液含盐量为五个单因素考察指标,优化提取工艺,确定最佳提取条件为:pH 6.5 的磷酸缓冲溶液（含 0.5 mol/L 的 NaCl）,在料液比 1:150 条件下浸提 2 次,每次浸提 12 h;此条件下 PEOR 提取率为 12.5%,经考马斯亮蓝法测得蛋白质含量为 60.7%;应用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定 PEOR 分子量分布,发现:PEOR 在 44.3-116 kDa 范围内主要有三个单体蛋白。对 PEOR 中氨基酸组成进行分析,结果表明:PEOR 中有 17 种氨基酸,其中 7 种为必需氨基酸,占 41.9%,氨基 酸总含量为
3、668.3 mg/g。以羟自由基清除率、DPPH 自由基清除率、超氧阴离子清除率和总还原力为体外抗氧化模型,VC 为阳性对照,评价 PEOR 体外抗氧化活性。结果表明,PEOR 清除羟自由基、DPPH 自由基和超氧阴离子的 IC50值分别为 4.85 mg/mL、4.98mg/mL 和 2.58 mg/mL;对 Fe3+的还原能力,在 A700 nm 值为 0.2 时,浓度为 11.8mg/mL。以丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和蛋白质羰基（PC）为指标,VC 为阳性对照,评价 PEOR 的体内抗氧化活性。结果表明,PEOR 能 降低小鼠体内 MDA 和 PC
4、含量,提高 GSH 和 SOD 水平,且呈量效关系。其中,400 mg/kg 的 PEOR 对负重游泳小鼠具有显著的抗疲劳作用,能延长小鼠的负重疲劳游泳时间,减少剧烈运动引起的血尿素氮（BUN）和血乳酸（BLA）的升高。胃蛋白酶/胰蛋白酶分步水解法制备林蛙油酶解肽的工艺条件为:脱脂林蛙油,加入 50 倍量人工胃液,水解 2 h,调节 pH 至 8.5,再次水解 4 h,水浴快速高 温灭酶。在此条件下林蛙油酶解肽的提取率为 31.5%;以羟自由基清除率、DPPH 清除率、超氧阴离子清除率和总还原力四个体系,VC 为阳性对照,考察林蛙油酶解肽抗氧化活性。结果表明,林蛙油酶解肽清除羟自由基、DPPH 和超氧阴离子的IC50值分别为 3.96 mg/mL、3.25 mg/mL 和 2.58 mg/mL;对Fe3+的还原能力,在 A700nm值为 0.2 时,浓度为 11.8 mg/mL。综合以上结果,PEOR 体内抗氧化效果优于体外,胃蛋白酶/胰蛋白酶分步水 解法制备的林蛙油酶解肽的抗氧化活性高于 PEOR。